זיהוי תפוקה גבוהה של שילובים תרופתיים סינרגטי בשיטת חפיפה2
Summary
שילובים תרופתיים סינרגטי הם וממושכת לזהות את הנתונים באופן אמפירי. כאן נתאר שיטת זיהוי ואימות של מולקולות קטנות סינרגטי.
Abstract
למרות סמים מיקרוביאלית הגדילו בצורה משמעותית את תוחלת החיים ואת איכות החיים בהמאה ה-20 , עמידות מיקרוביאלית מאיימת על יכולתה של החברה כולה שלנו לטיפול בדלקות מערכתית. בארצות הברית לבדה, זיהומים עמידים לאנטיביוטיקה להרוג כ- 23,000 אנשים בשנה ועלות בסביבות 20 מיליארד USD במערכת הבריאות נוספים. גישה אחת כדי להילחם עמידות מיקרוביאלית הוא טיפול משולב, אשר הוא שימושי במיוחד בשלב המוקדם קריטי של זיהום, לפני האורגניזם המזהם ופרופיל ההתנגדות שלה סמים זוהו. טיפולים מיקרוביאלית רבים להשתמש טיפולים משולבים. עם זאת, רוב אלה שילובים הם תוסף, כלומר היעילות המשולב הוא זהה לסכום היעילות לאנטיביוטיקה בודדים. כמה טיפולים משולבים הם סינרגטי: יעילות המשולבת היא הרבה יותר גדולה מאשר מוספים. שילוב סינרגטי שימושיים בעיקר כי הם יכולים לעכב את הצמיחה של זנים עמידים בפני התרופה מיקרוביאלית. עם זאת, אלה שילובים הם נדיר וקשה לזהות. זאת בשל המספר העצום של מולקולות צריך להיבדק באופן pairwise: ספריה של מולקולות 1,000 יש 1 מיליון צירופים אפשריים. לכן, נעשו מאמצים לחזות מולקולות סינרגיה. מאמר זה מתאר שיטת שלנו תפוקה גבוהה לחיזוי זוגות סינרגטי מולקולה קטנה המכונה את החפיפה2 שיטה (O2M). O2M משתמשת דפוסי מ datasets כימית-גנטית כדי לזהות מוטציות שאינן רגישות יתר כל מולקולה בזוג סינרגטי אך לא מולקולות אחרות. המעבדה חום מנצלת את ההבדל הצמיחה הזה על ידי ביצוע מסך תפוקה גבוהה עבור מולקולות כי לעכב את הצמיחה של מוטציה אבל לא פראי-סוג התאים. עבודת המעבדה זוהו בעבר מולקולות שמקושרות עם וטרימטופרים לאנטיביוטיקה את, תהליך הזיקוק של תרופה נגד פטריות באמצעות אסטרטגיה זו. . הנה, המחברים להציג שיטה למסך הרומן שילובים סינרגטי, אשר יכול להשתנות עבור מיקרואורגניזמים מרובים.
Introduction
חיידקים עמידים לאנטיביוטיקה לגרום זיהומים יותר מ-2 מיליון מקרי מוות 23,000 מדי שנה בארצות הברית על פי ה CDC1. חדש טיפולים נדרשים כדי להתגבר על זיהומים אלה. אסטרטגיות כדי לזהות טיפולים חדשים אלה כוללים הפיתוח של תרופות חדשות מיקרוביאלית או שינוי של מולקולות קטנות אישר תנאים אחרים לטיפול זיהומים חיידקים-2,–3,–4. אולם, גילוי תרופות חדשות הוא מאוד יקר וארוך. שינוי סמים לא יכול להזדהות תרופות חדישות או סמים מטרות5,6. המעבדה שלנו מתמקד אסטרטגיה שלישית המכונה שילוב סינרגיסטי טיפולים. שילוב סינרגטי להתרחש כאשר שתי מולקולות קטנות יש ביחד על יעילות יותר השפעת תוסף שלהם efficacies בודדים7. בנוסף, שילובים סינרגטי יכול להיות יעיל נגד פתוגן עמיד בפני אחד של מולקולות קטנות בזוג בנוסף פחות רצויות תופעות את המטרה, והוציאם נהדר פוטנציאליים8,9, 10.
זוגות סינרגטי הם נדירים, המתרחשים כ- 4-10% של סמים שילובים11,12,13. כך, טכניקות מסורתיות כגון מסכי pairwise הם מאתגרים וצורך, עם אלפי צירופים אפשריים של ספרייה קטנה של מולקולות מאה. יתר על כן, אינטראקציות סינרגטי בדרך כלל לא ניתן לחזות מן הפעילות של תרכובות14. עם זאת, המחברים פיתח גישה תפוקה גבוהה מסך עבור זוגות סינרגטי, קרא את החפיפה2 שיטה (O2M)12. שיטה זו, המתוארות כאן, מאפשר זיהוי מהיר יותר, יעיל יותר מכל הזוגות סינרגטי. O2M מחייב שימוש זוג סינרגטי ידוע dataset כימית-גנטיקה. כימית-גנטיקה datasets נוצרים כאשר ספרייה של knockout מוטציות גדל בנוכחות רבים מולקולות קטנות שונות. אם מולקולה אחת בזוג סינרגטי ידוע המניע את פנוטיפ זהה של מוטציה נוקאאוט מסוים כמו המולקולה סינרגטי השני, כל שאר מולקולה קטנה ולחושים של פנוטיפ של מוטציה זהה זה צריך גם שמקושרות עם כל חבר ידוע זוג סינרגטי. רציונל זה שימש במעבדה חום כדי לזהות זוגות לאנטיביוטיקה סינרגטי פעיל נגד Escherichia coli (e. coli) וזוגות תרופה נגד פטריות סינרגטי פעיל נגד הפטריה פתוגניים קריפטוקוקוס neoformans (C. neoformans)11,12. O2M הוא לא רק וישימה פתוגנים שונים, אבל מאפשר להקרנה של ספריות גדולות של מולקולות לזהות זוגות סינרגטי במהירות ובקלות. הקרנה עם המוטציה הגנטית המזוהה על-ידי O2M מאפשר לנו לאמת רק אלה מולקולות קטנות חזתה סינרגיה. לכן, בדיקות ספרייה 2,000-מולקולה של pairwise תיקח. חודשים, ואילו אם היו רק מולקולות 20 בספריה זו חזה לצוות, בדיקה של סינרגיה עכשיו לוקח עניין של ימים. O2M אינה דורשת יכולת תיכנות, הציוד הדרוש זמין ברוב מעבדות או מתקנים הליבה. בנוסף, חוקרים המעוניינים שילובים תרופתיים ניתוח O2M הוא עניין לכל אחד השלימה מסך הסמים ורוצה להרחיב את הלהיטים שלהם על-ידי זיהוי סמים חשוב-תרופתיות. להלן הוא פרוטוקול זיהוי מולקולות קטנות סינרגטי של חיידקים, כמו גם מאמת את האינטראקציות סינרגטי החזוי מבחני ידועים15,16.
Protocol
Representative Results
Discussion
מולקולה קטנה סינרגטי זוגות יכולים להיות כלי רב עוצמה לטיפול זיהומים חיידקים, אך הם לא הגיעו שלהם פוטנציאל קליני מלא כי זוגות סינרגטי מאתגרות לזיהוי. מאמר זה מתאר שיטה לזיהוי מהיר הרבה יותר פשוטה שילובים pairwise סינרגטי זוגות. באמצעות datasets כימית-גנטיקה, O2M מזהה מוטציות עם הסתרה ג’ין זה יוכל לשמ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענק הפעלה של המחלקה של פתולוגיה, אוניברסיטת יוטה כדי J.C.S.B.
Materials
| Bioscreen C | instrument | Growth Curves USA | |
| Synergy H1 | instrument | BioTek | |
| M9 broth | reagent | Amresco | J863-500G |
| Casamino Acids | reagent | Fisher Scientific | BP1424-500 |
| Glucose | reagent | Sigma | G7021-10KG |
| Nicotinic Acid | reagent | Alfa Aesar | A12683 |
| Thiamine | reagent | Acros Organics | 148991000 |
| CaCl2 Dihydrate | reagent | Fisher | C79-500 |
| MgSO4 Heptahydrate | reagent | Fisher | M63-500 |
| chemical-genetics dataset | dataset | examples include Nichols et al., Cell, 2011, Brown et al, Cell, 2014, and others cited in the text. | |
| trimethoprim (example input drug; any can be used) | reagent | Fisher Scientific | ICN19552701 |
| sulfamethoxazole (example test drug; any can be used) | reagent | Fisher Scientific | ICN15671125 |
References
- Michael, C. A., Dominey-Howes, D., Labbate, M. The Antimicrobial Resistance Crisis: Causes, Consequences, and Management. Front Public Health. 2, 145 (2014).
- Butts, A., Krysan, D. J. Antifungal Drug Discovery: Something Old and Something New. PLOS Pathogens. 8 (9), e1002870 (2012).
- Roemer, T., Krysan, D. J. Antifungal Drug Development: Challenges, Unmet Clinical Needs, and New Approaches. Cold Spring Harb Perspect Med. 4 (5), a019703 (2014).
- Oprea, T. I., Mestres, J. Drug Repurposing: Far Beyond New Targets for Old Drugs. AAPS J. 14 (4), 759-763 (2012).
- Scannell, J. W., Blanckley, A., Boldon, H., Warrington, B. Diagnosing the decline in pharmaceutical R&D efficiency. Nat Rev Drug Discov. 11 (3), 191-200 (2012).
- Rangel-Vega, A., Bernstein, L. R., Mandujano-Tinoco, E. A., García-Contreras, S. J., García-Contreras, R. Drug repurposing as an alternative for the treatment of recalcitrant bacterial infections. Front Microbiol. 6, 282 (2015).
- Torella, J. P., Chait, R., Kishony, R. Optimal Drug Synergy in Antimicrobial Treatments. PLoS Comput Biol. 6 (6), e1000796 (2010).
- Cowen, L. E., et al. Harnessing Hsp90 function as a powerful, broadly effective therapeutic strategy for fungal infectious disease. P Natl Acad Sci. 106 (8), 2818-2823 (2009).
- Zuo, G. -. Y., et al. Synergistic Antibacterial and Antibiotic Effects of Bisbenzylisoquinoline Alkaloids on Clinical Isolates of Methicillin-Resistant Staphylococcus Aureus (MRSA). Molecules. 16 (12), 9819 (2011).
- Jia, J., et al. Mechanisms of drug combinations: interaction and network perspectives. Nat Rev Drug Discov. 8 (2), 111-128 (2009).
- Wambaugh, M. A., Shakya, V. P. S., Lewis, A. J., Mulvey, M. A., Brown, J. C. S. High-throughput identification and rational design of synergistic small-molecule pairs for combating and bypassing antibiotic resistance. PLOS Biol. 15 (6), e2001644 (2017).
- Brown, J. C. S., et al. Unraveling the biology of a fungal meningitis pathogen using chemical genetics. Cell. 159 (5), 1168-1187 (2014).
- Cokol, M., et al. Systematic exploration of synergistic drug pairs. Mol Syst Biol. 7, 544-544 (2011).
- Borisy, A. A., et al. Systematic discovery of multicomponent therapeutics. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (13), 7977-7982 (2003).
- Tang, J., Wennerberg, K., Aittokallio, T. What is synergy? The Saariselkä agreement revisited. Front Pharmacol. 6, 181 (2015).
- Hsieh, M. H., Yu, C. M., Yu, V. L., Chow, J. W. Synergy assessed by checkerboard. A critical analysis. Diagn Microbiol Infect Dis. 16 (4), 343-349 (1993).
- Nichols, R. J., et al. Phenotypic Landscape of a Bacterial Cell. Cell. 144 (1), 143-156 (2011).
- Chandrasekaran, S., et al. Chemogenomics and orthology-based design of antibiotic combination therapies. Mol Syst Biol. 12 (5), (2016).
- Pradhan, A., et al. Chemogenomic profiling of Plasmodium falciparum as a tool to aid antimalarial drug discovery. Sci Rep. 5, 15930 (2015).
- Pethe, K., et al. A chemical genetic screen in Mycobacterium tuberculosis identifies carbon-source-dependent growth inhibitors devoid of in vivo efficacy. Nat Commun. 1 (5), 1-8 (2010).
- Diezmann, S., Michaut, M., Shapiro, R. S., Bader, G. D., Cowen, L. E. Mapping the Hsp90 Genetic Interaction Network in Candida albicans Reveals Environmental Contingency and Rewired Circuitry. PLoS Genetics. 8 (3), e1002562 (2012).
- Robbins, N., et al. An Antifungal Combination Matrix Identifies a Rich Pool of Adjuvant Molecules that Enhance Drug Activity Against Diverse Fungal Pathogens. Cell reports. 13 (7), 1481-1492 (2015).
- Wildenhain, J., et al. Prediction of Synergism from Chemical-Genetic Interactions by Machine Learning. Cell Syst. 1 (6), 383-395 (2015).
- Spitzer, M., et al. Cross-species discovery of syncretic drug combinations that potentiate the antifungal fluconazole. Mol Syst Biol. 7, 499-499 (2011).
