В этом исследовании мы назвали систему – ovo перспективным инструментом для тестирования инсулин подражательный соединений в живом организме. Основные преимущества включают в себя адекватной скорости и по приемлемым ценам, позволяющие идентификацию фитохимические с инсулин подражательный свойствами.
Уровень глюкозы в крови повышенный в сахарный диабет типа 2 (T2DM), сложных и многофакторных метаболических заболеваний, вызваны недостаточность инсулина сопротивления и β-клеток. Различные стратегии, включая инъекции инсулина или использование инсулина ознакомление наркотиков, были продолжены для лечения T2DM или по крайней мере уменьшить симптомы. Кроме того применение травяные соединений привлекает все большее внимание. Таким образом необходимо найти эффективный тест-системы для выявления и описания инсулин подражательный соединений. Здесь мы разработали модифицированных куриных эмбрионов модель, которая позволяет тестирование синтетических соединений и растительные экстракты с инсулин подражательный свойствами. С помощью флуоресценции микроскопии основанные начального экрана, который количественно транслокации транспортера глюкозы 4 (Glut4) к плазматической мембране, мы смогли определить соединений, преимущественно растительных экстрактов, которые ведут к увеличению внутриклеточных глюкозы концентрации в адипоцитов. Однако эффективность этих веществ требует дальнейшего контроля в живом организме. Таким образом мы использовали подход – ovo для определения их свойств снижение глюкозы в крови. Одобрения Комитета по этике не требуется, поскольку использование куриных эмбрионах в течение первых двух третей эмбрионального развития не считается эксперимент животных. Здесь подробно описывается применение этой модели.
Сахарный диабет является метаболически заболевание, характеризующееся гипергликемией и вызванные дефектами секреции инсулина или инсулин действий1. Девяносто процентов всех случаев диабета являются сахарный диабет типа 2 категории (T2DM), где люди демонстрируют сопротивление инсулина и основном инсулин дефицит2. Известно, что несколько факторов увеличения глобальных масштабов T2DM, включая изменения в образе жизни, особенно в связи с чрезмерным питанием, старения и отсутствие физической активности. Около 400 миллионов человек имеют сахарным диабетом во всем мире согласно Международной Федерации диабета (МФД). Это число, как ожидается, достигнет 600 млн в течение следующих 20 лет3.
Диабетических осложнений, вызванных гипергликемии и сопротивление инсулина, таких, как гипертония, дислипидемия, нетерпимость глюкозы, ишемической болезни сердца и церебрального сосудистого заболевания, приведет к значительному сокращению продолжительности жизни и качества4. Затронутые лица требуют сахаропонижающую фармакотерапии; Однако использование наркотиков, таких как метформин5 зачастую ассоциируется с драматическим побочные эффекты6,,78. Таким образом антидиабетические подходы, которые являются безопасными, широко доступен и недорогую необходимы дальнейшие.
Различные травяные соединений, экстракты, растения и нутрицевтики были приписывают инсулин подражательный свойства компонента, модулируя различных клеточных функций. Важной особенностью является стимулирование транслокации транспортера глюкозы 4 (GLUT4) к плазматической мембране от внутриклеточного отсеков, что приводит к увеличению поглощения глюкозы в мышцах и жировой ткани в отсутствие инсулина, известный как Инсулин подражательный свойства9. Ранее мы реализовали подход, основанный на микроскопии флуоресцирования, количественно оценить процесс транслокации GLUT410. Анализ многочисленных растительных экстрактов из экстракта библиотека11 используя этот assay привел к выявлению перспективных кандидатов. Однако необходимы дальнейшие испытания в живых организмах. Подход, подробно описываются в настоящем документе, изменение куриных эмбрионов модель, оказалась перспективной моделью для идентификации веществ с инсулин подражательный свойствами. Он представляет собой привлекательный инструмент заполнение широкий разрыв между в vivo и in vitro исследования и предлагает несколько преимуществ по сравнению с существующими системами по приемлемым ценам, простой обработки процедур и адекватной скорости. Кроме того не требуется разрешение Комитета по этике.
Assay HET-CAM является широко используются альтернативные испытания системы животных испытаний в промышленности12. Системы – ovo , описанные здесь представляет собой модифицированную версию HET-камеры assay. В его первоначальном виде, HET-CAM эксперименты по изучению раздражающих свойств соединений и разработки или анализа по ангиогенез14,,1516, мы адаптировали подход для тестирования соединения с предполагаемым инсулин подражательный характеристики12. Согласно директиве 2010/63/ЕС эксперименты с не вылупились птичьего эмбрионы в течение первых двух третей эмбрионального развития не нужно разрешение Комитета по этике, поскольку эти эксперименты не считаются экспериментов на животных. Недавние исследования доказали пригодность характеризуют эффективность отдельных растительных экстрактов, которые были определены на основе GLUT4-транслокации начального экрана10, чтобы снизить уровень глюкозы в крови в системе – ovo отсутствие инсулина12,13. Критические точки для хорошей производительности системы в ovo включают в себя: во-первых, надежного заводчика доставки оплодотворенные яйца. Lohmann классический коричневый курица это хороший выбор породы. Во-вторых осуществление токсичности тесты исключить токсические эффекты исследуемых соединений необходимо сделать. Кроме того подготовка подходящих кровеносный сосуд для сбора крови имеет важное значение. Важно избежать резки крупных судов в chorioallantoic мембраны, сам, как это может привести к не предпочтительнее потери крови. Кроме того, прежде чем судно разрезается на полосы рН, он должен быть похлопал сухой с помощью фильтровальной бумаги для предотвращения разбавления собранной крови. Наконец достаточное количество экспериментов, как представляется, важное значение. Мы рекомендуем использовать по крайней мере 10 яиц для каждой точке времени и трехкратное повторение соответствующих эксперимента.
Естественно существуют некоторые ограничения этого подхода в шоу ovo . Поскольку он занимает до 30 минут, пока вещества поглощаются через мембраны яичной скорлупы и вступить в тесный контакт с chorioallantoic мембраной, невозможно количественно быстрого реагирования эмбриона прикладной соединения. Кроме того некоторые соединения могут быть токсичными в прикладной концентрации, которая часто приводит к поражения кровеносных сосудов в chorioallantoic мембраны. Таким образом цитотоксичность тестирования на основе долгосрочных инкубации соединений для около 24 часов представляется разумной. Наконец мы нашли, что буферная система используется для применения соединений имеет значительное влияние на производительность assay. 12 в настоящее время HBSS буфер используется потому, что оно приводит к в наименьший эффект на уровень глюкозы в крови эмбриона.
Для будущих применений может испытываться дополнительные буферные системы в качестве альтернативы HBSS. Кроме того влияние экстрактов трав на крови дополнительных параметров, таких как холестерина, триглицеридов и липопротеидов, может быть привлекательным вопрос.
Нашей новой системы в ovo является перспективным и важным инструментом для тестирования вещества с инсулин подражательный характеристиками в живом организме без необходимости животного эксперимента. Таким образом он заполняет разрыв между подходами в vivo и in vitro . По сравнению с существующей в ovo модель систем17 существует не нужно вызвать диабет, лечение Стрептозотоцин (СТЗ), как мы используем эмбрионов в день 10 или 11 инкубации. На данном этапе не было начато производство инсулина, но эмбрионы уже чувствительной инсулина. Кроме того разрешение Комитета по этике может потребоваться, если используется17эмбрионов, в возрасте 14-17 дней. Кроме того по сравнению с альтернативным стратегиям18, составные приложения как описано здесь менее вредных и трудоемкий, увеличение экспериментальной через положило.
Вместе взятые, это -ovo подход является привлекательной системы, если кровь уменьшается эффект инсулина подражательный вещества должен испытываться в живом организме.
The authors have nothing to disclose.
Эта работа финансировалась австрийского Агентства по поощрению исследований (FFG; номер проекта 850681), Университет прикладных наук Верхняя Австрия Основные финансирование инициативы (проект GlucoSTAR) и центр для технологических инноваций в области медицины (временный центр) что получает базовое финансирование провинции Верхняя Австрия.
Phosphate buffered saline (PBS) | Biochrom | L1825 | |
Hank’s balanced salt solution (HBSS) | Thermo Scientific | SH30268.02 | |
NovoRapid | Novo Nordisk | 8-0905-82-304-6 | |
Hens eggs (Lohmann classic brown chicken) | Local Breeder | ||
Accu-check performa | Roche | 6454011 | |
Accu-check Inform II Teststreifen | Roche | 5942861 | |
Incubator HEKA- Turbo 288 | HEKA Brutgeräte | ||
Syringe Omnican F 1 mL | Braun | 09161502S | |
Extracts | PEKISH extract library | ||
Lamp Tempo Nr. 119 | ORBAN |