Dans cette étude, nous décrivons un système in-ovo comme un outil prometteur aux insulino-mimétiques composés d’essai dans un organisme vivant. Les principaux avantages comprennent un débit adéquat et des coûts acceptables, qui permettent l’identification de composés phytochimiques aux propriétés insulino-mimétiques.
Élevées de la glycémie dans le diabète sucré de type 2 (T2DM), une maladie métabolique complexe et multifactorielle, est dus insulino résistance et les cellules β. Différentes stratégies, y compris l’injection d’insuline ou l’utilisation de médicaments insulino-sensibilisateurs, se sont poursuivies à traiter T2DM ou au moins réduire les symptômes. En outre, l’application de composés à base de plantes a attiré une attention croissante. Ainsi, il est nécessaire de trouver des systèmes de test efficace pour identifier et caractériser les composés insulino-mimétiques. Ici, nous avons développé un modèle d’embryon de poussin mis à jour le, qui permet l’essai de composés synthétiques et des extraits de plantes ayant des propriétés insulino-mimétiques. À l’aide d’un fluorescence axée sur la microscopie écran principal, qui quantifie la translocation du transporteur de Glucose (Glut4) de 4 à la membrane plasmique, nous étions en mesure d’identifier les composés, principalement des extraits végétaux, qui conduisent à une augmentation du glucose intracellulaire concentrations dans les adipocytes. Cependant, l’efficacité de ces substances doit encore vérifier dans un organisme vivant. Ainsi, nous avons utilisé une approche in-ovo pour identifier leurs propriétés de réduction du glucose de sang. L’approbation par un Comité d’éthique n’est pas nécessaire puisque l’utilisation d’embryons de poulet pendant les deux premiers tiers du développement embryonnaire n’est pas considéré comme une expérimentation animale. Ici, l’application de ce modèle est décrite en détail.
Diabète sucré est une maladie métabolique caractérisée par une hyperglycémie et est causé par des défauts dans la sécrétion d’insuline ou l’insuline d’action1. Quatre-vingt-dix pour cent des cas de diabète sont catégorie mellitus de diabète de type 2 (T2DM), où les individus démontrent l’insulino-résistance et surtout l’insuline carence en2. Plusieurs facteurs sont connus pour augmenter l’incidence mondiale de T2DM, y compris les changements dans le mode de vie, en particulier celles liées à la suralimentation, le vieillissement et la sédentarité. Environ 400 millions de personnes ont le diabète dans le monde entier selon la Fédération internationale du diabète (FID). Ce nombre devrait atteindre 600 millions dans le prochain 20 ans3.
Complications liées au diabète provoquées par l’hyperglycémie et l’insulino-résistance, tels que l’hypertension, la dyslipidémie, l’intolérance au glucose, cardiopathie ischémique et maladie vasculaire cérébrale, conduisent à une espérance de vie considérablement réduite et qualité4. Les personnes concernées exigent une pharmacothérapie hypoglycémiant ; Cependant, l’utilisation de médicaments comme la metformine5 est souvent associée à des effets secondaires dramatiques6,7,8. Par conséquent, autres antidiabétiques des approches qui sont sûrs, largement disponibles et peu coûteux sont nécessaires.
Nutraceutiques, des extraits, des plantes et des différents composés à base de plantes ont été attribuées à des propriétés insulino-mimétiques de fonctionnalité en modulant les diverses fonctions cellulaires. Une caractéristique importante est la stimulation de la translocation du transporteur de glucose (GLUT4) de 4 à la membrane plasmique des compartiments de stockage intracellulaire, ce qui entraîne une augmentation de l’absorption du glucose dans les muscles et le tissu adipeux en l’absence d’insuline, connu sous le nom propriétés insulino-mimétiques9. Auparavant, nous avons mis en place une approche axée sur la microscopie de fluorescence pour quantifier le processus de translocation de GLUT410. Analyse de nombreux extraits de plantes de bibliothèque extrait11 à l’aide de ce test a permis l’identification de candidats prometteurs. Toutefois, des essais supplémentaires dans les organismes vivants sont requis. L’approche décrite en détail dans le présent document, un modèle d’embryon de poussin mis à jour le, s’est avéré pour être un modèle prometteur pour l’identification des substances ayant des propriétés insulino-mimétiques. Il représente un outil intéressant de combler l’écart entre les études in vitro et in vivo et offre plusieurs avantages par rapport aux systèmes existants tels que des coûts acceptables, procédures de manipulation simple et débits adéquats. En outre, l’autorisation par un Comité d’éthique n’est pas requise.
Le test de HET-CAM est un système de rechange largement utilisé pour les essais à l’expérimentation animale dans l’ industrie12. Le système in-ovo décrit ici représente une version modifiée du test HET-CAM. Alors que dans sa forme originale, HET-CAM expériences réalisées afin d’étudier les propriétés irritantes de composés et de la formulation ou l’analyse de l’angiogenèse14,15,16, nous avons adapté l’approche pour tester composés avec caractéristiques insulino-mimétiques putatif12. Selon la directive 2010/63/CE, expériences avec des embryons d’oiseaux non éclos durant les deux premiers tiers du développement embryonnaire n’ont pas besoin l’autorisation par un Comité d’éthique étant donné que ces expériences ne sont pas considérés comme des expérimentations animales. Des études récentes ont démontré la pertinence du système in-ovo pour caractériser l’efficacité des extraits de plantes sélectionnées, qui ont été identifiées dans un écran principal GLUT4-translocation à base10, afin de réduire le taux de glucose sanguin dans les absence d’insuline12,13. Points critiques pour une bonne performance du système en-ovo incluent : tout d’abord, un éleveur fiable offrant les œufs fécondés. La poule brune classique Lohmann est un bon choix de race. Deuxièmement, la mise en œuvre de toxicité teste d’exclure les effets toxiques de l’enquête composé doit être fait. En outre, la préparation d’un vaisseau sanguin adéquat pour la collecte de sang est importante. Il est important d’éviter la découpe de gros bateaux dans la membrane chorio-lui-même, car cela peut entraîner une perte non-préférable de sang. En outre, avant que le navire est coupé sur la bande de pH, il doit être tapoté sèche à l’aide de papier filtre pour éviter la dilution du sang recueilli. Enfin, un nombre suffisant d’expériences semble être important. Nous vous recommandons d’utiliser au moins 10 oeufs pour chaque point dans le temps et une triple répétition de l’expérience respective.
Naturellement, il y a certaines limites de cette approche dans-ovo . Puisque cela prend jusqu’à 30 minutes, jusqu’à ce que les substances sont absorbés à travers la membrane coquillère et entrent en contact direct avec la membrane chorio-, il n’est pas possible de quantifier une réponse rapide de l’embryon à la pâte appliquée. En outre, certains composés peuvent être toxiques dans la concentration appliquée, ce qui entraîne fréquemment des lésions des vaisseaux sanguins dans la membrane chorio. Ainsi, il semble raisonnable de cytotoxicité test basé sur la longue durée d’incubation des composés pendant environ 24 heures. Enfin, nous avons constaté que le système de tampon utilisé pour l’application des composés a un effet significatif sur la performance du test. 12 actuellement, tampon HBSS est utilisée car elle se traduit par le plus petit effet sur le taux de glucose sanguin de l’embryon.
Pour de futures applications, systèmes tampon supplémentaire comme une alternative aux HBSS pourraient être testés. En outre, l’influence d’extraits de plantes sur les paramètres sanguins supplémentaires tels que le taux de cholestérol, de triglycérides ou de lipoprotéines pourrait être une question attrayante.
Notre nouveau système de dans-ovo est un outil prometteur et important pour tester les substances possédant des caractéristiques insulino-mimétiques dans un organisme vivant sans la nécessité d’une expérimentation animale. Par conséquent, il comble le fossé entre les approches in vitro et in vivo . En comparaison de l’existant en-ovo modèle systèmes17 il n’y a aucun besoin pour induire le diabète par le traitement de la streptozotocine (STZ), car nous utilisons des embryons au jour 10 ou 11 de l’incubation. À ce stade, la production d’insuline n’a pas commencé, mais les embryons sont déjà sensibles de l’insuline. En outre, l’autorisation par un Comité d’éthique peut être nécessaire si les embryons âgés de 14 à 17 jours sont utilisé17. En outre, par rapport aux stratégies alternatives18, l’application composée tel que décrit ici est moins nocive et laborieux, augmentation des taux d’à travers-put expérimentales.
Pris ensemble, cette in-ovo approche est un système attrayant si un effet de diminution de sang d’une substance insulino-mimétiques doit être testée dans un organisme vivant.
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été financé par l’Agence de Promotion de recherche autrichienne (FFG ; numéro du projet 850681), l’University of Applied Sciences Upper Austria base financement initiative (projet GlucoSTAR) et le Centre pour l’Innovation technologique en médecine (TIMed Center) qui reçoit un financement de base de la province de Haute-Autriche.
Phosphate buffered saline (PBS) | Biochrom | L1825 | |
Hank’s balanced salt solution (HBSS) | Thermo Scientific | SH30268.02 | |
NovoRapid | Novo Nordisk | 8-0905-82-304-6 | |
Hens eggs (Lohmann classic brown chicken) | Local Breeder | ||
Accu-check performa | Roche | 6454011 | |
Accu-check Inform II Teststreifen | Roche | 5942861 | |
Incubator HEKA- Turbo 288 | HEKA Brutgeräte | ||
Syringe Omnican F 1 mL | Braun | 09161502S | |
Extracts | PEKISH extract library | ||
Lamp Tempo Nr. 119 | ORBAN |