Neste estudo, descrevemos um sistema no ovo como uma ferramenta promissora para testar compostos insulino-mimética em um organismo vivo. As principais vantagens incluem taxas de transferência adequada e a custos aceitáveis, que permitam a identificação de fitoquímicos com propriedades insulino-mimética.
Níveis elevados de glicose no diabetes mellitus tipo 2 (T2DM), uma doença metabólica complexa e multifatorial, são causados por falha de resistência e β-célula de insulina. Várias estratégias, incluindo a injeção de insulina ou o uso de medicamentos insulino-sensibilizantes, foram perseguidas para tratar T2DM ou pelo menos reduzir os sintomas. Além disso, a aplicação de compostos à base de plantas tem atraído cada vez mais atenção. Assim, é preciso encontrar sistemas de teste eficiente para identificar e caracterizar compostos insulino-mimética. Aqui nós desenvolvemos um modelo de embrião de pintinho modificados, que permite testes de compostos sintéticos e extractos de ervas com propriedades insulino-mimética. Usando uma fluorescência baseado em microscopia tela primária, que quantifica a translocação do transportador de glicose (Glut4) de 4 para a membrana plasmática, fomos capazes de identificar compostos, principalmente extratos de ervas, que levam a um aumento de glicose intracelular concentrações nos adipócitos. No entanto, a eficácia destas substâncias requer mais verificação em um organismo vivo. Assim, usamos uma abordagem no ovo para identificar suas propriedades de redução de glicose do sangue. A aprovação por um Comitê de ética não é necessário desde que a utilização de embriões de galinha durante os primeiros dois terços do desenvolvimento embrionário não é considerada um experimento animal. Aqui, a aplicação deste modelo é descrita em detalhes.
Diabetes mellitus é uma doença metabólica caracterizada por hiperglicemia e é causada por defeitos na secreção de insulina ou de ação de insulina1. Noventa por cento de todos os casos de diabetes são categoria diabetes mellitus tipo 2 (T2DM), onde os indivíduos demonstram resistência à insulina e principalmente insulina deficiência2. Vários fatores são conhecidos por aumentar a incidência global de T2DM, incluindo mudanças de estilo de vida, particularmente as relacionadas com overnutrition, Envelhecimento e sedentarismo. Cerca de 400 milhões de pessoas têm diabetes mellitus em todo o mundo de acordo com a Federação Internacional de Diabetes (IDF). Esse número deve chegar a 600 milhões dentro os próximos 20 anos3.
Complicações do diabético causadas por hiperglicemia e resistência à insulina, tais como hipertensão arterial, dislipidemia, intolerância à glicose, doença coronariana e doença vascular cerebral, levam a um significativamente reduzida expectativa de vida e de qualidade4. Indivíduos afetados requerem farmacoterapia reduzindo a glicose; no entanto, o uso de drogas, como a metformina5 é frequentemente associado com efeitos colaterais dramáticos6,7,8. Portanto, mais antidiabéticos abordagens que são seguros, amplamente disponível e barato são necessárias.
Nutracêuticos, extratos, plantas e compostos de ervas diferentes tenham sido atribuídos Propriedades insulino-mimética característica modulando várias funções celulares. Uma característica importante é a estimulação de translocação do transportador de glicose (GLUT4) de 4 para a membrana plasmática de compartimentos de armazenamento intracelular, resultando em um aumento da absorção de glicose no músculo e tecido adiposo, na ausência de insulina, conhecida como Propriedades insulino-mimética9. Anteriormente, nós implementamos uma abordagem baseada em microscopia de fluorescência para quantificar o processo de translocação de GLUT410. Análise de numerosos extractos de plantas de uma biblioteca de extrato11 usando este ensaio resultou na identificação de candidatos promissores. No entanto, testes em organismos vivos são necessários. A abordagem descrita detalhadamente neste trabalho, um modelo de embrião de pintinho modificados, provou para ser um modelo promissor para a identificação de substâncias com propriedades insulino-mimética. Representa uma ferramenta atraente, enchendo o abismo entre os estudos in vitro e in vivo e oferece várias vantagens em comparação com sistemas existentes, tais como custos aceitáveis, procedimentos de manuseio simples e taxas de transferência adequada. Além disso, a permissão por uma Comissão de ética não é necessária.
O ensaio de HET-CAM é um sistema amplamente utilizado testes alternativos à experimentação animal no setor12. O sistema no ovo descrito aqui representa uma versão modificada do ensaio HET-CAM. Enquanto em sua forma original, são realizados experimentos de HET-CAM para estudar as propriedades irritantes de compostos e formulação ou a análise da angiogênese14,15,16, adaptámos a abordagem para testar compostos com características insulino-mimética putativo12. De acordo com a Directiva 2010/63/UE, experiências com embriões aviários não-nascidos durante os primeiros dois terços do desenvolvimento embrionário não precisa de permissão por um Comité de ética desde que estas experiências não são consideradas as experiências com animais. Estudos recentes demonstraram a adequação do sistema no ovo para caracterizar a eficácia de extratos de ervas selecionadas, que foram identificados em uma tela principal GLUT4 translocação-com base em10, para reduzir os níveis de glicose do sangue na ausência de insulina12,13. Pontos críticos para um bom desempenho do sistema no ovo incluem: primeiro, um criador de confiança entregar os ovos fertilizados. A galinha marrom clássica de Lohmann é uma boa escolha da raça. Em segundo lugar, a implementação de toxicidade testes para excluir os efeitos tóxicos do composto investigado precisa ser feito. Além disso, a preparação de um vaso sanguíneo adequado para coleta de sangue é importante. É importante evitar o corte de grandes vasos na membrana corioalantoicas em si, como isso pode levar a uma não-preferível perda de sangue. Além disso, antes do navio é cortado na faixa de pH, tem que ser revistado seco usando papel de filtro para evitar a diluição do sangue coletado. Finalmente, um número suficiente de experiências parece ser importante. Nós recomendamos usar pelo menos 10 ovos para cada ponto de tempo e uma tríplice repetição do experimento respectivo.
Naturalmente, há algumas limitações desta abordagem no ovo . Uma vez que leva até 30 minutos até que as substâncias são absorvidas através da membrana da casca e entraram em contato com a membrana corioalantoicas, não é possível quantificar uma resposta rápida do embrião para o composto aplicado. Além disso, alguns compostos podem ser tóxicos na concentração aplicada, que frequentemente resulta em lesões dos vasos sanguíneos na membrana corioalantoicas. Assim, testes de citotoxicidade baseado em incubação a longo prazo dos compostos por cerca de 24 horas parece razoável. Finalmente, achamos que o sistema de tampão usado para aplicação dos compostos tem um efeito significativo sobre o desempenho do ensaio. 12 -atualmente, HBSS buffer é usado porque resulta no menor efeito sobre os níveis de glicose do sangue do embrião.
Para futuras aplicações, sistemas de reserva adicionais como uma alternativa ao HBSS podem ser testados. Além disso, a influência de extratos de plantas medicinais em parâmetros adicionais de sangue, como colesterol, triglicérides ou lipoproteínas pode ser uma pergunta atraente.
Nosso novo sistema no ovo é uma ferramenta importante e promissor para testar substâncias com características insulino-mimética em um organismo vivo sem a necessidade de uma experiência animal. Portanto, ele preenche a lacuna entre abordagens in vitro e in vivo . Em comparação com os existentes no ovo modelo sistemas17 não há nenhuma necessidade para induzir diabetes por tratamento de estreptozotocina (STZ), como nós usamos os embriões no dia 10 ou 11 de incubação. Nesta fase, não se tenha iniciado a produção de insulina, mas os embriões já são sensíveis de insulina. Além disso, permissão por uma Comissão de ética pode ser necessário se embriões com idades entre 14-17 dias são usados17. Além disso, em comparação com estratégias alternativas18, o aplicativo composto conforme descrito aqui é menos prejudiciais e laborioso, aumentando as taxas de através de-colocar experimentais.
Tomados em conjunto, esta no ovo abordagem é um sistema atraente se um efeito de diminuição de sangue de uma substância insulino-mimética precisa ser testado em um organismo vivo.
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi financiado pela Agência de promoção de pesquisa austríaco (FFG: Projeto número 850681), a iniciativa da University of Applied Sciences Upper Austria financiamento básico (projeto GlucoSTAR) e o centro de inovação tecnológica na medicina (centro de temporizado) que recebe financiamento básico pela província de Alta Áustria.
Phosphate buffered saline (PBS) | Biochrom | L1825 | |
Hank’s balanced salt solution (HBSS) | Thermo Scientific | SH30268.02 | |
NovoRapid | Novo Nordisk | 8-0905-82-304-6 | |
Hens eggs (Lohmann classic brown chicken) | Local Breeder | ||
Accu-check performa | Roche | 6454011 | |
Accu-check Inform II Teststreifen | Roche | 5942861 | |
Incubator HEKA- Turbo 288 | HEKA Brutgeräte | ||
Syringe Omnican F 1 mL | Braun | 09161502S | |
Extracts | PEKISH extract library | ||
Lamp Tempo Nr. 119 | ORBAN |