Summary

Прижизненные изображения двух Фотон лейкоцитов во время иммунный ответ в мыши Липополисахарид лечение печени

Published: February 06, 2018
doi:

Summary

Мы создали Роман хирургический протокол для двух Фотон томография печени живых мышей с минимальным вторжением. С этой техникой мы определили подробную структуру печени во время Липополисахарид индуцированной эндотоксемии. Мы ожидаем, что этот метод может использоваться для определения эффективности различных реагентов лечения печёночной лейкоцитарной миграции.

Abstract

Сепсис — это тип тяжелой инфекции, которая может вызвать отказ органов и тканей повреждения. Хотя показатели смертности и заболеваемости связанные с сепсисом являются чрезвычайно высоким, нет прямого обращения или связанных с органа механизма рассматривался подробно, в режиме реального времени. Печень является ключевым органом, который управляет токсинов и инфекций в организме человека. Здесь мы стремились выполнить прижизненные изображения мыши печени после индукции эндотоксемии, чтобы отслеживать сократительной способности иммунных клеток, таких как нейтрофилы и макрофаги печени капсульные (LCMs). Соответственно мы разработали новый хирургический метод для экспозиции печени с минимально инвазивной хирургии. Мышей внутрибрюшинно вводили с липополисахарида (LPS), общие эндотоксин. Используя наш Роман хирургический подход для экспозиции и прижизненные изображения мыши печени, мы обнаружили, что нейтрофилов вербовки в LPS-лечение LysM Зеленый флуоресцентный белок (ГПУП) мыши печени был увеличен по сравнению с этим в фосфат амортизированное солевой раствор лечение печени. После лечения LPS со временем значительно увеличилось количество нейтрофилов. Кроме того с помощью мыши CX3Cr1-GFP, мы успешно визуализирована печени-резидентов макрофаги, называется LCMs. Таким образом чтобы исследовать эффективность новых реагентов для управления иммунной мобильности в естественных условиях, определении подвижности и морфология нейтрофилов и LCMs в печени может позволить нам определить терапевтический эффект в орган тканей и неудачи ущерб, причиненный активации лейкоцитов в сепсиса.

Introduction

Печень является основным метаболических органом в млекопитающих; Он действует как башня управления для энергии, гормоны и детоксикации1. Из-за ее важности исследователи провели много in vitro и in vivo экспериментов для выяснения изменений в печени при воспалении. Для захвата изображений в реальном времени из печени2 был использован прижизненной микроскопии. Действительно различные печени, что тепловизионные методы были введены2,3,4,5,6. Однако с тем чтобы разработать более упрощенный хирургический подход и добиться стабилизации органа-мишени и иммунных клеток, мы разработали простой протокол, который может руководствоваться исследователи для сведения к минимуму их усилий для прижизненной визуализации.

В этом исследовании мы ввели стабильной и Роман тепловизионные камеры и хирургической техники, которые могут быть использованы для сведения к минимуму кровотечения и возможных инфекций. Мы подтвердили, что печень остается неизменным для более чем 2 ч. С помощью этого метода мы успешно определили морфологии LCMs7 и нейтрофилов под септические состояния. Поскольку этот метод минимизирует физических и биологических отягощающих факторов, таких как дрожали и неожиданные воспаления при хирургической процедуры, мы ожидаем, что этот метод может быть использован для наблюдения острых реакций иммунных клеток в печени в ответ на Реагенты, как LPS.

Protocol

Все процедуры были проведены в соответствии с руководящими принципами институциональный уход животных и использования Комитета Йонсейского университета колледж медицины, Корея. LysM Зеленый флуоресцентный белок (GFP; gfp / +) мышах8 и CX3Cr1-GFP (gfp / +)9 мышей в возрасте 8-1…

Representative Results

Простой и очень стабильная тепловизионные камеры была разработана. В нижней части камеры была покрыта силикона, который предотвратить соскальзывание мыши тела и органов. Кроме того потому что кремний имеет правильное количество упругости, он может препятствовать ож?…

Discussion

Печени активно изучается многими группами3,10, ввиду важности его функции. К примеру Хейманн et al. предложил деликатный метода, с помощью агарозы. Хотя этот метод оказался весьма точные, параметр агарозы занимает время. Однако с нашей методологии, все процед…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Это исследование было поддержано грант от национального исследования Фонда из Кореи (NRF) финансируется правительством Кореи (MSIP; 2016R1A2B4008199 Грант № Y-м. H.), Министерство здравоохранения и социального обеспечения, Республика Корея (номер гранта: HI14C1324).

Materials

Custom designed chamber Live Cell Instruments Custom-designed size
Metal cover slide Live Cell Instruments Custom-designed size
Cover glass Electron Microscopy Sciences #72204-03
Sylgard 184 Silicone elastomer kit Dow Corning
Erlenmeyer flask DURAN 21 216 36
Cell culture plate (Flat type) HYUNDAI Micro Co. H31006
Desiccator ADARSH 55204
High Q BOND SE 5 mL BJM LAB To make semi-permanent dam
Flexible Silicone Rubber Heaters Omega SRFR/SRFG SERIES, M1250/0800
DC power supply Toyotech DP30-03A
Phosphate-buffered saline Home-made
Lipopolysaccharides (LPS) from Salmonella enteria serotype enteritidis Sigma-Aldrich L6011
Texas Red Dextran Thermo Fisher Scientific D1830
15 mL High-clarity polypropylene
conical tube
FALCON 14-959-49B
0.45 μm filter (Minisart Syringe Filter) Sartorius 16555k
1.5ml Micro Tube, Amber Axygen MCT-150-X For light-blocking
1 mL syringe Korea Vaccine KV-S01
3 mL syringe Korea Vaccine KV-S03
10 mL syringe Korea Vaccine KV-S10
0.3 mL insulin syringe Becton Dickinson 324900
Hair removal cream 100 mL Body natur
Cotton swab ABDI
Zoletil 50 5 mL Virbac
Rompun 10 mL Bayer
Heating plate Live Cell Instruments PH-S-10 Custom-designed size
DC controller Live Cell Instruments CU-301
Microdessection Scissors Harvard Apparatus 72-5418
Scissors Roboz RS-5882
Forceps Roboz RS-5137
Vet bond 3M 1469SB
ZEN software (Black Edition) Carl Zeiss Program for LSM 7 MP
LSM 7 MP Carl Zeiss
Volocity PerkinElmer Analysis program

References

  1. Girard, J. R., et al. Fuels, hormones, and liver metabolism at term and during the early postnatal period in the rat. J Clin Invest. 52 (12), 3190-3200 (1973).
  2. Marques, P. E., et al. Imaging liver biology in vivo using conventional confocal microscopy. Nat Protoc. 10 (2), 258-268 (2015).
  3. Dasari, S., Weber, P., Makhloufi, C., Lopez, E., Forestier, C. L. Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics. J Vis Exp. (101), e52303 (2015).
  4. Honda, M., et al. Intravital imaging of neutrophil recruitment in hepatic ischemia-reperfusion injury in mice. Transplantation. 95 (4), 551-558 (2013).
  5. Jenne, C. N., Wong, C. H., Petri, B., Kubes, P. The use of spinning-disk confocal microscopy for the intravital analysis of platelet dynamics in response to systemic and local inflammation. PLoS One. 6 (9), e25109 (2011).
  6. Ritsma, L., et al. Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis. Sci Transl Med. 4 (158), 158ra145 (2012).
  7. Sierro, F., et al. A Liver Capsular Network of Monocyte-Derived Macrophages Restricts Hepatic Dissemination of Intraperitoneal Bacteria by Neutrophil Recruitment. Immunity. 47 (2), 374-388 (2017).
  8. Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96 (2), 719-726 (2000).
  9. Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol Cell Biol. 20 (11), 4106-4114 (2000).
  10. Heymann, F., et al. Long term intravital multiphoton microscopy imaging of immune cells in healthy and diseased liver using CXCR6.Gfp reporter mice. J Vis Exp. (97), (2015).

Play Video

Cite This Article
Park, S. A., Choe, Y. H., Lee, S. H., Hyun, Y. Two-photon Intravital Imaging of Leukocytes During the Immune Response in Lipopolysaccharide-treated Mouse Liver. J. Vis. Exp. (132), e57191, doi:10.3791/57191 (2018).

View Video