Summary

اثنين-فوتون تصوير إينترافيتال من الكريات البيضاء خلال الاستجابة المناعية في الكبد تعامل Lipopolysaccharide الماوس

Published: February 06, 2018
doi:

Summary

قمنا بإنشاء بروتوكول جراحية رواية لتصوير اثنين-فوتون من كبد الفئران حية مع الحد الأدنى من الغزو. مع هذا الأسلوب، حددنا الهيكل التفصيلي للكبد خلال اندوتوكسيميا الناجمة عن lipopolysaccharide. ونحن نتوقع أن يمكن استخدام هذا الأسلوب تحديد مدى فعالية العلاج الكواشف المختلفة لهجرة الكريات البيض الكبد.

Abstract

تعفن الدم هو نوع من العدوى الحادة التي يمكن أن تتسبب في فشل الأعضاء والأنسجة، والضرر. على الرغم من أن معدلات الوفيات والإصابة بالأمراض المرتبطة الانتان هي العلاج مرتفعة للغاية، لا مباشرة أو الآلية المتصلة بالجهاز وقد درست بالتفصيل في الوقت الحقيقي. الكبد هو الجهاز الرئيسي الذي يتحكم بالسموم والالتهابات في جسم الإنسان. هنا، نحن بهدف القيام بتصوير إينترافيتال للكبد الماوس بعد تحريض اندوتوكسيميا من أجل تتبع الحركية الخلايا المناعية، مثل العَدلات والكبد الضامة الحافظة (LCMs). وبناء على ذلك، قمنا بتصميم طريقة جراحية رواية للتعرض للكبد مع الحد الأدنى من جراحة. تم حقن الفئران إينترابيريتونيلي lipopolysaccharide (LPS)، الذيفان مشتركة. استخدام النهج الجراحية رواية للتعرض والتصوير إينترافيتال لتعيين الماوس الكبد، وجدنا أن العَدلات في المعالجة بلبس ليسم-أخضر نيون البروتين (التجارة والنقل) والماوس الكبد زيد مقارنة مع ذلك في مخزنة الفوسفات الكبد المعالجة بالمياه المالحة. بعد العلاج لبس، زيادة عدد العَدلات كبيرة مع مرور الوقت. بالإضافة إلى ذلك، باستخدام الفئران CX3Cr1-التجارة والنقل، ونحن بنجاح تصور الضامة المقيم الكبد تسمى لكمس. ولذلك، للتحقيق في كفاءة الكواشف الجديدة للتحكم في التنقل محصنة في فيفو، تحديد حركية ومورفولوجيا العَدلات ولكمس في الكبد قد تسمح لنا بتحديد التأثير العلاجي في الجهاز فشل والأنسجة، والأضرار التي تسببها تنشيط الكريات البيضاء في الانتان.

Introduction

الكبد هو الجهاز الأيضية الرئيسية في الثدييات؛ أنها بمثابة برج مراقبة ل الطاقة والهرمونات والسموم1. نظراً لأهميته، وقد أجرى الباحثون العديد من التجارب في المختبر و في فيفو توضيح التغيرات في الكبد أثناء التهاب. وقد استخدمت الفحص المجهري إينترافيتال لالتقاط صور حية من الكبد2 . وفي الواقع، قدم الكبد مختلف أساليب التصوير منذ2،،من34،،من56. ومع ذلك، بغية وضع نهج مبسطة أكثر العمليات جراحية وتحقيق الاستقرار للجهاز المستهدف والخلايا المناعية، قمنا بتصميم بروتوكول بسيطة التي يمكن أن توجه الباحثين التقليل من جهودهم لتصوير إينترافيتال.

في هذه الدراسة، ونحن أدخلت غرفة التصوير مستقرة والرواية وتقنية جراحية يمكن استخدامها للتقليل من الإصابات نزيف وممكن. وأكد نحن أن الكبد لا تزال سليمة لأكثر من 2 ح. مع هذا الأسلوب، وحددنا بنجاح مورفولوجيس لكمس7 والعدلات تحت ظروف الصرف الصحي. حيث يقلل هذا الأسلوب عوامل الخلط الفيزيائي والبيولوجي مثل التهاب يرتجف وغير متوقعة أثناء إجراء العمليات الجراحية، ونتوقع أنه يمكن استخدام هذا الأسلوب لمراقبة ردود فعل حادة من الخلايا المناعية في الكبد ردا على مثل الكواشف لبس.

Protocol

وقد أجريت جميع الإجراءات وفقا للمبادئ التوجيهية لرعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة يونسي جامعة كلية الطب، كوريا. بروتين فلوري أخضر ليسم (التجارة والنقل؛ التجارة والنقل/+) الفئران8 و CX3Cr1-التجارة والنقل (التجارة والنقل/+)9 الفئران في الأسابيع 8-12 من العمر كانت ت…

Representative Results

وقد وضعت دائرة تصوير بسيط ومستقر جداً. تمت تغطية الجزء السفلي من الدائرة مع السيليكون، مما حال دون الانزلاق للجسم الماوس والأجهزة. بالإضافة إلى ذلك، بسبب السيليكون كمية مناسبة من مرونة، فإنه يمكن منع الأضرار المتوقعة الناجمة عن الضغط لغطاء الشريحة (الشكل 1 أ</s…

Discussion

ودرست بنشاط الكبد بالعديد من المجموعات3،10، نظراً لأهمية وظيفتها. على سبيل المثال، اقترح هيمان وآخرون طريقة حساسة باستخدام [اغروس]. على الرغم من أن هذا الأسلوب عثر على وجه الدقة العالية، الإعداد [اغروس] يستغرق وقتاً طويلاً. بيد مع منهجيتنا، جميع الإجراءات يم?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

كان يؤيد هذه الدراسة بمنحه مقدمة من الوطنية بحوث مؤسسة من كوريا (جبهة الخلاص الوطني) تموله حكومة كوريا (مسيب؛ ومنحة رقم 2016R1A2B4008199 Y-م. حاء)، ووزارة الصحة والرعاية الاجتماعية، جمهورية كوريا (منح رقم: HI14C1324).

Materials

Custom designed chamber Live Cell Instruments Custom-designed size
Metal cover slide Live Cell Instruments Custom-designed size
Cover glass Electron Microscopy Sciences #72204-03
Sylgard 184 Silicone elastomer kit Dow Corning
Erlenmeyer flask DURAN 21 216 36
Cell culture plate (Flat type) HYUNDAI Micro Co. H31006
Desiccator ADARSH 55204
High Q BOND SE 5 mL BJM LAB To make semi-permanent dam
Flexible Silicone Rubber Heaters Omega SRFR/SRFG SERIES, M1250/0800
DC power supply Toyotech DP30-03A
Phosphate-buffered saline Home-made
Lipopolysaccharides (LPS) from Salmonella enteria serotype enteritidis Sigma-Aldrich L6011
Texas Red Dextran Thermo Fisher Scientific D1830
15 mL High-clarity polypropylene
conical tube
FALCON 14-959-49B
0.45 μm filter (Minisart Syringe Filter) Sartorius 16555k
1.5ml Micro Tube, Amber Axygen MCT-150-X For light-blocking
1 mL syringe Korea Vaccine KV-S01
3 mL syringe Korea Vaccine KV-S03
10 mL syringe Korea Vaccine KV-S10
0.3 mL insulin syringe Becton Dickinson 324900
Hair removal cream 100 mL Body natur
Cotton swab ABDI
Zoletil 50 5 mL Virbac
Rompun 10 mL Bayer
Heating plate Live Cell Instruments PH-S-10 Custom-designed size
DC controller Live Cell Instruments CU-301
Microdessection Scissors Harvard Apparatus 72-5418
Scissors Roboz RS-5882
Forceps Roboz RS-5137
Vet bond 3M 1469SB
ZEN software (Black Edition) Carl Zeiss Program for LSM 7 MP
LSM 7 MP Carl Zeiss
Volocity PerkinElmer Analysis program

References

  1. Girard, J. R., et al. Fuels, hormones, and liver metabolism at term and during the early postnatal period in the rat. J Clin Invest. 52 (12), 3190-3200 (1973).
  2. Marques, P. E., et al. Imaging liver biology in vivo using conventional confocal microscopy. Nat Protoc. 10 (2), 258-268 (2015).
  3. Dasari, S., Weber, P., Makhloufi, C., Lopez, E., Forestier, C. L. Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics. J Vis Exp. (101), e52303 (2015).
  4. Honda, M., et al. Intravital imaging of neutrophil recruitment in hepatic ischemia-reperfusion injury in mice. Transplantation. 95 (4), 551-558 (2013).
  5. Jenne, C. N., Wong, C. H., Petri, B., Kubes, P. The use of spinning-disk confocal microscopy for the intravital analysis of platelet dynamics in response to systemic and local inflammation. PLoS One. 6 (9), e25109 (2011).
  6. Ritsma, L., et al. Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis. Sci Transl Med. 4 (158), 158ra145 (2012).
  7. Sierro, F., et al. A Liver Capsular Network of Monocyte-Derived Macrophages Restricts Hepatic Dissemination of Intraperitoneal Bacteria by Neutrophil Recruitment. Immunity. 47 (2), 374-388 (2017).
  8. Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96 (2), 719-726 (2000).
  9. Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol Cell Biol. 20 (11), 4106-4114 (2000).
  10. Heymann, F., et al. Long term intravital multiphoton microscopy imaging of immune cells in healthy and diseased liver using CXCR6.Gfp reporter mice. J Vis Exp. (97), (2015).

Play Video

Cite This Article
Park, S. A., Choe, Y. H., Lee, S. H., Hyun, Y. Two-photon Intravital Imaging of Leukocytes During the Immune Response in Lipopolysaccharide-treated Mouse Liver. J. Vis. Exp. (132), e57191, doi:10.3791/57191 (2018).

View Video