Un método de Optogenetic para controlar y analizar patrones de expresión génica en las interacciones célula a célula
Summary
Aquí, presentamos un protocolo para analizar la transferencia de célula a célula de información oscilatoria por control optogenetic y control de la expresión génica en vivo. Este enfoque proporciona una plataforma única para probar una significación funcional de los programas de dinámica gene expresión en sistemas multicelulares.
Abstract
Células deben responder correctamente al cambio temporal de entornos, que están influidos por varios factores desde que rodea las células. La muesca que se vía de señalización es una de dichas máquinas moleculares esenciales para la comunicación de célula a célula, que juega un papel clave en el desarrollo normal de embriones. Esta vía consiste en una transferencia de célula a célula de información oscilatoria con Ritmos ultradianos, pero a pesar de los avances en técnicas de biología molecular, ha estado desafiando a dilucidar los efectos de interacciones multicelulares gen oscilatoria dinámica. Aquí, presentamos un protocolo que permite optogenetic control y seguimiento directo de los patrones de expresión génica de manera temporal precisa. Este método con éxito reveló que entradas periódicas intracelulares e intercelulares de la señalización de Notch arrastrar las oscilaciones intrínsecas por sintonización de frecuencias y fase de cambio en la resolución de unicelulares. Este enfoque es aplicable para el análisis de las características dinámicas de varias vías de señalización, ofreciendo una plataforma única para probar una significación funcional de los programas de dinámica gene expresión en sistemas multicelulares.
Introduction
Comunicación de célula a célula juega papeles críticos en modelar embrionario en procesos de desarrollo. En embriones de vertebrados, las estructuras metaméricos, llamadas somitas se forman a lo largo del eje corporal antero-posterior con una precisa exactitud temporal bajo el control de un reloj de tiempo, llamado el reloj de segmentación1. Durante este proceso, un grupo de células del mesoderm presomitic (PSM) se convierten periódicamente en somitas en forma sincrónica. Este proceso implica la expresión génica oscilatoria sincronizada y forma de las células PSM que oscilan en fase el mismo somitas. El período de la expresión génica oscilatoria es alrededor de 2 a 3 h en ratones y unos 30 min en el pez cebra. Cuando disociado, PSM células pierden la sincronía2,3, pero cuando son nuevamente agregadas, puede auto-organizarse y recuperar la población sincronía4, sugiriendo que el acoplamiento de la célula es una clave para la sincronización oscilaciones.
Esfuerzos extensos revelaron que moléculas de señalización en la vía de Notch Delta están conectadas firmemente a las oscilaciones sincronizadas de los genes de reloj de segmentación. Inhibidores farmacológicos o mutaciones genéticas de la señalización de Notch desincronizando la población de los osciladores. En el pez cebra, mutantes de la muesca señalización componentes como DeltaC, DeltaD y Notch1a, Mostrar oscilaciones asincrónicas5,6. En embriones de pollo o el ratón, el ligando de Notch Delta-like1 (Dll1), sino también el muesca modulador Lunatic fringe (Lfng) se requiere para oscilaciones sincronizadas7,8,9. Sin embargo, ha sido difícil para poner a prueba la capacidad funcional de estas moléculas para la transferencia de información dinámica de célula a célula, porque las resoluciones temporales de perturbación convencional de la dinámica de regulación gen no eran suficientes para investigar la procesos de escalas de tiempo de 2-3 h (Ritmos ultradianos).
Recientemente hemos desarrollado un método integrado para controlar y supervisar patrones de expresión de genes en células de mamíferos10. Esta tecnología permite la inducción de pulsos de expresión del gene por iluminación de luz periódica en escalas de tiempo ultradianos. Este protocolo representa los métodos para establecer líneas de células fotosensibles y observar respuestas dinámicas de las células de reportero por luminiscencia de células vivas en los contextos de la comunicación de célula a célula. Este método es aplicable para el análisis de muchas otras vías de señalización.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mostramos un método para controlar la dinámica de expresión de genes con una periodicidad de 2 a 3 h. Esta escala de tiempo es mucho más corta que los de otros sistemas convencionales, incluyendo el sistema Tet y el original sistema de LightOn. Parámetros clave para llegar a las escalas de tiempo ultradianos son la vida media de productos molecular inducida por la foto, mRNAs y proteínas. Estos parámetros cinéticos pueden depender de las especies y tipos celulares. Para afinar la cinética, sustituir secuencias d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por JST, PRESTO (A.I.), núcleo investigación evolutiva de la ciencia y tecnología (JPMJCR12W2 (r)), subvenciones para la investigación científica en áreas innovadoras (Ministerio de educación, cultura, deportes, ciencia y tecnología (MEXT), Japón 26119708 (e) y 16 H 06480 (R.K.)), científico (A) (sociedad japonesa para la promoción de la ciencia (JSPS) 24240049 (r)), de investigación y jóvenes científicos (A) (JSPS 15 H 05326 (A.I.)) y subvenciones para la investigación científica en áreas innovadoras “de la fluorescencia Vivo imagen”del MEXT, Japón y plataforma para enfoques dinámicos a vivos de MEXT, Japón.
Materials
| FACS | Becton, Dickinson and Company | FACSAriaII SORP | |
| Camera | Andor | iKon M-934 | |
| Microscope | Olympus | IX-81 ZDC | |
| PMT device | Churitsu eletric corp. | CL24B-LIC/B | |
| Blue LED illuminator | OptoCode | LEDB-SBOXH | |
| DMEM | Nacalai | 08459-35 | |
| Penicillin-streptomycin | Nacalai | 26253-84 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | 172012 | |
| KRYSTAL24 (black 24 well plate ) | Hi-tech | 303012 | |
| D-Luciferin Potassium Salt | Nacalai | 20028-24 | |
| Light meter | LI-COR Biosciences | LI-250A | |
| anti-HA-Peroxidase antibody | Roche | clone 3F10 | |
| anti-Actin-Peroxidase antibody | Wako | clone 2F3 |
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