制御、細胞間相互作用における遺伝子発現パターンを分析して光遺伝学的方法
Summary
ここでは、振動情報の光遺伝学的制御による細胞間伝達を分析および遺伝子発現のモニタリング ライブにプロトコルを提案する.この方法は、多細胞系における動的遺伝子発現プログラムの機能的意義をテストするためのユニークなプラットフォームを提供します。
Abstract
セルは、一時的、変化する周囲のセルから様々 な要因によって影響を受けている環境に適切に対応する必要があります。ノッチ シグナル伝達経路は、胚の正常な発達に重要な役割を果たしている細胞間の通信にこのような重要な分子機械のひとつです。この経路を含むウルトラディアン リズムと振動情報のセルに転送が、振動遺伝子における多細胞間相互作用の影響を解明する分子生物学的手法の進歩にもかかわらずチャレンジしておりますダイナミクス。ここでは、光遺伝学的制御と正確な一時的な方法で遺伝子発現パターンのライブ監視を可能にするプロトコルを提案する.このメソッドは正常に、Notch シグナルの細胞内および細胞間の周期的な入力同調固有振動周波数と位相シフト単一セルの解像度であることを明らかにしました。この方法は、多細胞系における動的遺伝子発現プログラムの機能的意義をテストするためのユニークなプラットフォームを提供する、様々 なシグナル伝達経路の動的特徴の解析に適用されます。
Introduction
細胞間通信は、発達過程で胚のパターン形成に重要な役割を果たします。脊椎動物の胚は、体節と呼ばれる体節構造と身体前後軸に沿って分割クロック1と呼ばれる計時時計の制御の下で一時的な精度で形成されています。このプロセス中に、presomitic 中胚葉 (PSM) セルのグループは、定期的に同期的な方法で体節に変換されます。このプロセスは、同期振動遺伝子発現と位相で振動 PSM 細胞同じ距離。振動遺伝子発現の期間は、約 2、3 時間マウス、ゼブラフィッシュでは約 30 分です。PSM 細胞は同期の2,3を失う解離場合が、再集計が、彼らを自己組織化でき、回復、人口同調4細胞間結合が、同期のためのキーであることを示唆振動。
広範な努力では、デルタ Notch 経路のシグナル伝達分子がセグメンテーション時計遺伝子の同期した振動にしっかりと接続されていることを明らかにしました。薬理学的阻害剤や Notch シグナルの遺伝の突然変異は、発振器の人口を desynchronize します。ゼブラフィッシュ、Notch シグナル コンポーネント、DeltaC、DeltaD、Notch1a などの変異体は、非同期振動5,6を表示します。ひよこやマウス胚では、ノッチ リガンド デルタ 1 に似た (Dll1) だけでなく、ノッチ変調器狂気フリンジ (Lfng) が同期した振動7,8,9に必要です。しかし、それされているセルからセルに動的な情報転送のためのような分子の機能をテストすることは困難摂遺伝子調節動態の時空間解像度を調査するための不足のため、2-3 h (ウルトラディアン リズム) の時間スケールのプロセス。
最近、哺乳類細胞10の遺伝子の発現パターンを制御し、監視する統合的な手法を開発しました。この技術によりウルトラジアン リズムの時間スケールで定期的な照明、遺伝子式パルス誘導します。このプロトコルは、感光性細胞ラインを確立し、細胞間コミュニケーションの文脈で監視ライブ セル発光によるレポーター細胞の動的応答を観察する方法を表します。このメソッドは、他の多くのシグナル伝達経路の解析に適用されます。
Protocol
Representative Results
Discussion
我々 は 2-3 h の周期性と遺伝子発現ダイナミクスを制御する手法を示した。このタイム スケールはテトのシステムと元のライトン システムなどを含む他の従来のものよりもはるかに短い。ウルトラジアン リズムの時間スケールに到達するための重要なパラメーターは、光誘起分子製品、Mrna、タンパク質の半減です。これらの速度論的パラメーターは、セルタイプおよび種によって異なりま?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、進化科学技術 (JPMJCR12W2 (R.K.))、革新的な地域 (文部省、文化、スポーツ、科学、および技術 (文部科学省)、日本の科学研究費補助金科学技術振興機構、さきがけ (人工知能)、コア研究によって支えられました。26119708 (人工知能) と 16 H 06480 (R.K.))、科学 () (日本学術振興会 (JSPS) 24240049 (R.K.))、研究、若手研究 (A) (日本学術振興会 15 H 05326 (人工知能)) と、新学術研究領域「蛍光ライブ イメージング」文部科学省、日本、そしてプラットフォームの動的アプローチの生活システムを文部科学省、日本から。
Materials
| FACS | Becton, Dickinson and Company | FACSAriaII SORP | |
| Camera | Andor | iKon M-934 | |
| Microscope | Olympus | IX-81 ZDC | |
| PMT device | Churitsu eletric corp. | CL24B-LIC/B | |
| Blue LED illuminator | OptoCode | LEDB-SBOXH | |
| DMEM | Nacalai | 08459-35 | |
| Penicillin-streptomycin | Nacalai | 26253-84 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | 172012 | |
| KRYSTAL24 (black 24 well plate ) | Hi-tech | 303012 | |
| D-Luciferin Potassium Salt | Nacalai | 20028-24 | |
| Light meter | LI-COR Biosciences | LI-250A | |
| anti-HA-Peroxidase antibody | Roche | clone 3F10 | |
| anti-Actin-Peroxidase antibody | Wako | clone 2F3 |
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