Un metodo di optogenetica per controllare e analizzare il pattern di espressione genica nelle interazioni della cellula--cellula
Summary
Qui, presentiamo un protocollo per analizzare la cellula–cellula trasferimento di informazioni oscillatori di optogenetica controllo e monitoraggio dell’espressione genica live. Questo approccio fornisce una piattaforma unica per testare un significato funzionale dei programmi di espressione genica dinamici nei sistemi pluricellulari.
Abstract
Cellule devono rispondere correttamente a cambiare temporaneamente gli ambienti, che sono influenzati da vari fattori da cellule circostanti. Il via di segnalazione di Notch è uno di tali macchinari molecolari essenziali per le comunicazioni cellula–cellula, che svolge ruoli chiave nello sviluppo normale degli embrioni. Questa via comporta un trasferimento di cellula–cellula di informazioni oscillatorie con Oscillazioni ultradiane, ma nonostante i progressi nelle tecniche di biologia molecolare, è stato impegnativo per delucidare l’impatto delle interazioni multicellulari sul gene oscillatoria dinamica. Qui, presentiamo un protocollo che consente la gestione di optogenetica e monitoraggio in tempo reale di espressione genica in modo temporale preciso. Questo metodo con successo ha rivelato che intracellulari e intercellulari ingressi periodici della tacca di segnalazione entrain oscillazioni intrinseche di frequenza di sintonizzazione e fase spostando la risoluzione di singole cellule. Questo metodo è applicabile per l’analisi delle caratteristiche dinamiche delle varie vie di segnalazione, fornendo una piattaforma unica per testare un significato funzionale dei programmi di espressione genica dinamici nei sistemi pluricellulari.
Introduction
Comunicazione della cellula–cellula giocano un ruolo critico nel patterning embrionale in processi di sviluppo. In embrioni vertebrati, le strutture metamerica chiamate somiti si formano lungo l’asse antero-posteriore corpo con una precisione temporale precisa sotto il controllo di un orologio di tempo di mantenimento, chiamato la segmentazione dell’orologio1. Durante questo processo, un gruppo di cellule del mesoderma presomitic (PSM) periodicamente vengono convertiti in somiti in modo sincrono. Questo processo coinvolge l’espressione genica di oscillatori sincronizzati e cellule PSM che oscillano in fase formano dei metameri stessi. Il periodo dell’espressione genica oscillatorio è circa 2-3 h in topi e a circa 30 min in zebrafish. Quando dissociate, PSM cellule perdono la sincronia2,3, ma quando sono ri-aggregati, possono auto-organizzarsi e recuperare la popolazione sincronia4, suggerendo che l’accoppiamento cellula-cellula è una chiave per il sincronizzato oscillazioni.
Gli sforzi profusi hanno rivelato che le molecole di segnalazione nella via del Delta-Notch strettamente collegate alle oscillazioni sincronizzate dei geni orologio segmentazione. O inibitori farmacologici o mutazioni genetiche della tacca di segnalazione desincronizzarsi la popolazione degli oscillatori. In zebrafish, mutanti della tacca di segnalazione componenti, quali DeltaC, DeltaD e Notch1a, visualizzano asincrona oscillazioni5,6. Negli embrioni di pulcino o il mouse, non solo il ligando Notch Delta-like1 (Dll1), ma anche il tacca modulatore Lunatic fringe (Lfng) è richiesto per oscillazioni sincronizzata7,8,9. Tuttavia, è stato difficile testare la funzionalità di tali molecole per il trasferimento di informazioni dinamiche da cella a cella, perché risoluzioni temporali di perturbazione convenzionale della dinamica di regolazione genica non erano sufficienti per indagare il processi di tempistiche di 2 – 3 h (ultradiane).
Recentemente abbiamo sviluppato un metodo integrato per controllare e monitorare pattern di espressione genica in cellule di mammifero10. Questa tecnologia consente ad induzione di impulsi di espressione genica di illuminazione a luce periodici su scale di tempo ultradiane. Questo protocollo rappresenta i metodi per stabilire linee di cellule fotosensibili e osservare le risposte dinamiche delle cellule reporter di luminescenza di cellule vive di monitoraggio nei contesti delle comunicazioni cellula–cellula. Questo metodo è applicabile per l’analisi di molte altre vie di segnalazione.
Protocol
Representative Results
Discussion
Abbiamo mostrato un metodo per controllare le dinamiche di espressione genica con una periodicità di h 2 o 3. Questa scala temporale è molto più breve rispetto a quelle di altri sistemi convenzionali, tra cui il sistema Tet-On e il sistema LightOn originale. Parametri chiave per raggiungere le scale temporali ultradiane sono emivite di prodotti molecolari indotti da foto, mRNA e proteine. Questi parametri cinetici possono dipendere di specie e tipi di cellule. Per la sintonizzazione la cinetica, sostituendo sequenze H…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato da JST, PRESTO (A.I.), Core ricerca evolutiva di scienza e tecnologia (JPMJCR12W2 (R.K.)), sovvenzione per la ricerca scientifica in settori innovativi (Ministero della pubblica istruzione, cultura, sport, scienza e tecnologia (MEXT), Giappone 26119708 (A.I.) e 16 H 06480 (R.K.)), scientifico (A) (Giappone società per la promozione della scienza (JSPS) 24240049 (R.K.)), di ricerca e giovani ricercatori (A) (JSPS 15 H 05326 (A.I.)) e una sovvenzione per la ricerca scientifica in settori innovativi “fluorescenza Live imaging”del MEXT, Giappone e piattaforma per approcci dinamici a Living System da MEXT, Giappone.
Materials
| FACS | Becton, Dickinson and Company | FACSAriaII SORP | |
| Camera | Andor | iKon M-934 | |
| Microscope | Olympus | IX-81 ZDC | |
| PMT device | Churitsu eletric corp. | CL24B-LIC/B | |
| Blue LED illuminator | OptoCode | LEDB-SBOXH | |
| DMEM | Nacalai | 08459-35 | |
| Penicillin-streptomycin | Nacalai | 26253-84 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | 172012 | |
| KRYSTAL24 (black 24 well plate ) | Hi-tech | 303012 | |
| D-Luciferin Potassium Salt | Nacalai | 20028-24 | |
| Light meter | LI-COR Biosciences | LI-250A | |
| anti-HA-Peroxidase antibody | Roche | clone 3F10 | |
| anti-Actin-Peroxidase antibody | Wako | clone 2F3 |
References
- Hubaud, A., Pourquie, O. Signalling dynamics in vertebrate segmentation. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 15, 709-721 (2014).
- Maroto, M., Dale, J. K., Dequeant, M. L., Petit, A. C., Pourquié, O. Synchronised cycling gene oscillations in presomitic mesoderm cells require cell-cell contact. Int. J. Dev. Biol. 49, 309-315 (2005).
- Masamizu, Y., Ohtsuka, T., Takashima, Y., Nagahara, H., Takenaka, Y., Yoshikawa, K., Okamura, H., Kageyama, R. Real-time imaging of the somite segmentation clock: revelation of unstable oscillators in the individual presomitic mesoderm cell. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103, 1313-1318 (2006).
- Tsiairis, C., Aulehla, A. Self-Organization of Embryonic Genetic Oscillators into Spatiotemporal Wave Patterns. Cell. 164, 656-667 (2016).
- Jiang, Y. J., Aerne, B. L., Smithers, L., Haddon, C., Ish-Horowicz, D., Lewis, J. Notch signalling and the synchronization of the somite segmentation clock. Nature. 408, 475-479 (2000).
- Delaune, E. A., François, P., Shih, N. P., Amacher, S. L. Single-cell-resolution imaging of the impact of Notch signaling and mitosis on segmentation clock dynamics. Dev. Cell. 23, 995-1005 (2012).
- Dale, J. K., Maroto, M., Dequeant, M. L., Malapert, P., McGrew, M., Pourquié, O. Periodic inhibition by Lunatic Fringe underlies the chick Segmentation Clock. Nature. 421, 275-278 (2003).
- Okubo, Y., Sugawara, T., Abe-Koduka, N., Kanno, J., Kimura, A., Saga, Y. Lfng regulates the synchronized oscillation of the mouse segmentation clock via trans-repression of Notch signalling. Nat. Commun. 3, 1141 (2012).
- Shimojo, H., Isomura, A., Ohtsuka, T., Kori, H., Miyachi, H., Kageyama, R. Oscillatory control of Delta-like1 in cell interactions regulates dynamic gene expression and tissue morphogenesis. Genes Dev. 30, 102-116 (2016).
- Isomura, A., Ogushi, F., Kori, H., Kageyama, R. Optogenetic perturbation and bioluminescence imaging to analyze cell-to-cell transfer of oscillatory information. Genes Dev. 31, 524-535 (2017).
- Wang, X., Chen, X., Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system. Nat. Meth. 9, 266-269 (2012).
- Imayoshi, I., Isomura, A., Harima, Y., Kawaguchi, K., Kori, H., Miyachi, H., Fujiwara, T. K., Ishidate, F., Kageyama, R. Oscillatory control of factors determining multipotency and fate in mouse neural progenitors. Science. 342, 1203-1208 (2013).
- Kawakami, K. Tol2: a versatile gene transfer vector in vertebrates. Genome Biol. 8, S7 (2007).
- Yagita, K., Yamanaka, I., Emoto, N., Kawakami, K., Shimada, S. Real-time monitoring of circadian clock oscillations in primary cultures of mammalian cells using Tol2 transposon-mediated gene transfer strategy. BMC Biotechnology. 10, 3 (2010).
- Filonov, G. S., Piatkevich, K. D., Ting, L. -. M., Zhang, J., Kim, K., Verkhusha, V. V. Bright and stable near-infrared fluorescent protein for in vivo imaging. Nat. Biotechnol. 29, 757-761 (2011).
- Gregor, T., Fujimoto, K., Masaki, N., Sawai, S. The onset of collective behavior in social amoebae. Science. 328, 1021-1025 (2010).
- Kellogg, R. A., Tay, S. Noise facilitates transcriptional control under dynamic inputs. Cell. 160, 381-392 (2015).
