Chips de microfluídica para dispersión ligera dinámica In Situ mediante difracción de rayos x de cristal y In Situ para la cristalografía Serial

Epoxy es un material de relleno excelente para la fabricación de la viruta de la radiografía. Es barata, sencilla y robusta al proceso sin necesidad de herramientas especializadas (figura 1). Reducción de viscosidad de epoxy diluyendo con 40 wt % de etanol facilita la eliminación del exceso de resina sobre el pozo de la cristalización, dando por resultado definido x-Ray windows. Diluciones de etanol superiores dio lugar a defectos en la resina curada. Mediante el análisis de cortes transversales de viruta de la radiografía, se determinó el espesor total de la ventana de ambos lados que unos 19 μm de espesor, que está muy cerca el espesor nominal de las láminas de poliimida usado de 2 × 7.5 μm (figura 2) Ensayos de cristalización fueron aislados en varios nanoliter tamaño reacción compartimentos cada uno, utilizando un mecanismo capilar válvula como se describe anteriormente41. Esta técnica de ‘store-entonces-crear’ carga evita la pérdida de la muestra de canal muerto-volumen y fácilmente se puede realizar manualmente, eliminando la necesidad de utilizar bombas u otro equipo de impulsión de fluidos42. El chip es imprimar con aceite fluorado antes de cargar la muestra acuosa. La tensión superficial en la interfase aceite-agua entre aceite de cebado y los resultados de la muestra acuosa en una diferencia de presión a través de la interfaz. Esta presión de Laplace depende del radio de curvatura y la tensión superficial de la interfaz. Para reducir al mínimo su energía, la interfaz debe minimizar su superficie, que es equivalente a maximizar sus radios principales de curvatura en el volumen constante. Una interfaz de baja curvatura en un canal de ancho tiene una menor presión de Laplace entonces una interfaz de alta curvatura en un segmento de canal estrecho. Por lo tanto, la toma de muestra preferencial entra y atraviesa el ancho Puente canal en lugar de fluir a través de las restricciones de válvula capilar estrecho. Por último, la toma de muestra es seguida por aceite fluorado para separar los pocillos de la muestra en gotas independientes. Carga robusta y fiable se logró con caudales de hasta 1 mL/h en una serie y un arreglo bien paralelo (figura 3). En el diseño ‘serial’, bien entrada y capilares constricción de la válvula está conectados secuencialmente a través de un puente canal31. En contraste, en el diseño ‘paralelo’, dos canales principales separados conectan todas las entradas bien o capilar válvulas sólo43. Anteriormente ya se habían combinados ambos conceptos de acuerdo con el control de la formulación a la composición de la pantalla, que es un aspecto útil en la cristalización de la proteína43,44. El diseño de la serie tiene sólo dos puertos fluidos, una entrada y una salida. Tiene menos puertos líquidos y debido a esto, es más sencillo de construir y operar. El diseño paralelo tiene 4 puertos de fluido, 2 para el canal principal que conecta los pozos y 2 para ligarse encima de las válvulas capilares para dejar aire o escape de exceso de aceite. Carga por lo tanto puede proceder de ambos lados del canal principal. Este diseño en general tiene menor resistencia al flujo para igual número de pozos debido a su puente más corto. Por lo tanto es más adecuado para dispositivos a escala con un alto número de pozos. Además, los pozos de muestra son orientados más cerca juntos, que ofrece ventajas para el automatizado de la proyección de imagen. Muestra completa carga bien se observó para ambos diseños, si bien construido como una altura de dos o un diseño de tres altura. En un diseño de dos alturas, la muestra bien y los canales de derivación son de igual altura. El diseño de tres altura requiere una tercera máscara, canales de derivación de una capa adicional de SU8 y un paso de alineación para asegurar que los pozos de muestra ser mayores que la anterior. Esta diferencia de altura promueve la entrada de líquido de la muestra en el pozo a través del mismo tubo capilar válvula principio que detiene el flujo en las limitaciones. Aquí, el techo más bien corresponde a una baja presión de Laplace del menisco y flujo a lo largo de la dirección de puente avance sólo es favorecida después de pozos han llenado completamente las limitaciones de la válvula bloquean flujo y desviación por la carretera de circunvalación. Sin embargo, carga exitoso no requiere estrictamente los pozos a ser mayor que el by-pass válvula capilar adecuado puede lograrse también mediante el ajuste de anchos de canal por consiguiente. Sin embargo, en nuestra experiencia, los pozos más altos realizaron significativamente más robusto y carga libre de defecto se observó en hasta diez veces mayores tasas de flujo en todos los diseños de tres altura en comparación con sus equivalentes de dos alturas. Este efecto fue más pronunciado en el diseño paralelo. Para imitar la cinética de cristalización de la difusión de vapor, la permeabilidad finita de la hoja del polyimide fue explotada para controlar la evaporación del agua con el tiempo. Tasas de evaporación experimental fueron cuantificadas mediante el control del cambio de volumen de gota con el tiempo al equiparar el área superficial de la gota y bien de altura (figura 4). La evaporación de los pozos de la cristalización en la viruta de la radiografía no procede de manera lineal, como una superficie que encoge de la gota coincidiendo con el aumento de resultados de la concentración de solutos en una tasa de evaporación reducida en tiempo45. La evaporación inicial siguió un ritmo aproximadamente lineal de alrededor de 0,5 nL h-1 en los pozos de la geometría de la composición serial. Para entender mejor la cinética de cristalización, DLS fueron mediciones en los pozos de la cristalización del chip microfluídico. Para la medición inicial de DLS, un chip PDMS en una diapositiva de cristal se utilizó para proporcionar mejores propiedades ópticas para el experimento de dispersión de la luz. Este chip tenía las mismas dimensiones así como la viruta de la radiografía. PDMS tiene una mayor permeabilidad de vapor de agua que la poliamida de las ventanas de polyimide en los rayos x chip45. Puesto que las escalas de flujo linealmente con la distancia, la trayectoria de evaporación de un polyimide ventana bien puede combinarse con una ventana correspondiente de PDMS de espesor apropiado. DLS los resultados muestran que la distribución de la radio cambia con el tiempo (Figura 4A-B), demostrando que las medidas DLS permiten para detectar la nucleación inicial antes de que se observan partículas cristalinas primera. Esta información puede utilizarse para nuclear y crecer monocristales por pozo externamente ajustando la tasa de evaporación y por lo tanto niveles de sobresaturación en una etapa temprana de la nucleación46. La viruta de la radiografía se fijó en un adaptador 3D impreso para el goniómetro de placa compatible de SBS en la línea de EMBL de sincrotrón P14 en PETRA III (figura 5A). Alternativamente, un marco impreso 3D más pequeños puede utilizarse para chips de montaje radiografía estándar línea Goniómetros21. La taumatina cristales tienen un tamaño de 10-20 μm (figura 5B) y difractan hasta una resolución de 2.0 Å (figura 5). Como era de esperar, la contribución del fondo de rayos x de las dos ventanas de láminas de poliimida fino de la viruta de la radiografía se limita a anillos de dispersión de polímero de poliamida 11 Å (2θ = ~ 5°) y 33 Å (2θ = ~ 1,7 °) para la longitud de onda rayos x 0.97 Å. Estos dos anillos no molestan procesamiento de datos. Se recolectó un conjunto de datos total 83 cristales de extractos de plantas y 10 patrones de difracción fueron registrados de cada cristal con una rotación de 1° en cada fotograma. Procesamiento de datos y parámetros de refinamiento, así como las estadísticas de la base de datos de extractos de plantas son listadas y comparadas con los dos otros conjuntos de datos de isomerasa de glucosa y tiorredoxina que también fueron recogidos en situ se enumeran en la tabla 3 y Tabla 4. El decaimiento de la intensidad de la potencia normalizada de la difracción en el tiempo fue investigado por la división del conjunto de datos de extractos de plantas en cinco sub conjuntos de datos (dos patrones de difracción fueron utilizados por subconjunto para mantener conjuntos de datos completos). Como se muestra en la Figura 6B, el poder de difracción comenzó a disminuir después de la primera base de datos de sub y fue inferior al 50% en el cuarto conjunto de sub. Como resultado, los valores Rmeas de los sub conjuntos de datos también están aumentando con el tiempo, lo que indica daño de la radiación de rayos x durante la recolección de datos. Presumimos que los radicales libres generados durante la exposición de la radiografía rápidamente degradan cristales vecinos en el mismo compartimiento de la reacción. Por ejemplo, tales daños de rayos x secundarios fueron que menos pronunciado en un enfoque experimental relacionado, donde los cristales se han distribuido sobre un área significativamente mayor en un sandwich de poliamida21. Para minimizar los daños de rayos x general, sólo un pequeño número de patrones de difracción de un cristal particular debe ser recogido a temperatura ambiente. También, se debe exponer solamente un cristal de proteína solo por compartimiento del chip microfluídico. Sin embargo, todos los modelos de estructura refinados utilizando los conjuntos de datos procesados muestran muy buena estereoquímica y estadística adecuado (tabla 4). Además, todos los mapas de densidad electrónica final fueron de muy buena calidad. En anteriores enfoques de Cristalografía en chips transparentes de rayos x, la orientación y arreglo de los cristales tenía que ser manipulado deliberadamente para obtener una distribución al azar de cristal orientaciones40 o fue obtenido por movimientos de cristal dentro de la capa de líquido21. Para evaluar la orientación del cristal en los chips de microfluídica transparente radiografía descrito en el presente Protocolo, se determinó la orientación de la célula de unidad de todos los cristales expuestos con respecto al sistema de coordenadas de laboratorio. Para los cristales bipiramidales de taumatina, una ligera preferencia se observó (Figura 7A), mientras que se obtuvo una distribución amplia de cristales de glucosa isomerasa (figura 7B). Razonamos que en la escala de nanómetros, mayoría de los materiales exhibe significativa rugosidad. Por lo tanto, cristales podían espontáneamente nuclear sobre la superficie en significativamente menos orientaciones sesgadas espontáneamente. Un núcleo de cristal puede estar bloqueado en una orientación, sin dejar de crecer al tamaño adecuado sin reorientar con respecto a la normal de la superficie. De hecho, nucleation superficie cristal mediada ha sido una molestia para cristalógrafos tratando de lazo un cristal conectado fuera de la superficie sin dañar el cristal en el proceso. Aquí, podemos utilizar directamente tales cristales para recopilación de datos de difracción. Sin embargo, existen limitaciones específicas del sistema, como la tiorredoxina reveló una fuerte preferencia por ciertas orientaciones en el xy, xz y yz-planos (figura 7). Demuestran los ejemplos demostrados que la distribución de la orientación no solo depende en el ambiente de crecimiento sino también en la forma de cristal. Los cristales de la tiorredoxina han alargado formas que tienden a crecer en la orientación preferida, mientras que los cristales de la taumatina bipiramidal tetragonal o los cristales de isomerasa de glucosa ortorrómbica no muestran este comportamiento. Sin embargo, en todos los casos, incluso con orientaciones recomendado: la gama accesible de rotaciones de cristal resultó en suficientemente buena cobertura del espacio recíproco y datos completos por lo tanto para todos investigado las proteínas. Así, medidas adicionales no tuvieron que ser tomado al seleccionar cristales para la exposición de rayos. Figura 1 : Esquema de microfluidos fabricación de chips de rayos x. (1) SU-8 se dispensa en un sustrato de silicio y centrifugado recubiertos para obtener el espesor de la capa deseada. (2) fotoprotección está expuesta a la radiación UV a través de una mascarilla. (3) sin exponer photoresist entonces es desarrollado lavando consecutivamente con PGMEA y isopropanol, resultando en (4) un maestro SU-8 para el bastidor más pasos. (5) PDMS está empapada, y (6) después de curado el molde del PDMS, se pela el amo de SU-8. pegamento de epoxi (7a) se dispensa en el molde de PDMS y (7b) una lámina de polyimide activado químicamente a la resina de epoxy. (8) después de curar, se pela la hoja de poliimida con la película de epoxy fina con motivos del molde de PDMS. (9) en un último paso, el dispositivo es con tapa con una segunda hoja de polyimide para rendir una cerrado bajo rayos x fondo microfluídicos la viruta. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2 : Fotografía (izquierda) e imágenes de microscopia de cortes transversales de las fichas del finales. Se muestran un segmento representativo canal (medio) y un pozo de cristalización (derecha) de dos chips separados. Las flechas indican distancias medidas. Todas las dimensiones están en μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3 : Diseños de esquemas de cristalización bien con [un] paralelo o disposición serial [B], visto desde arriba y de lado, con dimensiones que se indican en μm. Alturas típicas del canal fueron: bypass de 50 μm, 50-60 μm cristalización bien, 5-10 μm capilar válvula, correspondiente bien volúmenes de unos 2,5 nL (diseño en paralelo) y 8 nL (disposición serial). Representante de carga bien del comportamiento se muestra utilizando colorantes alimentarios. El chip fue preparado con 12% en peso de 1H, 1 H, 2H, 2H-perfluoro-1-octanol en FC-43, antes de colorante alimentario fue inyectado en los pozos de almacenamiento. Las flechas blancas indican la dirección del flujo. Imágenes Resumen de mostrar dispositivos cargados todos los pozos cargados defecto carga libre, ilustrando muestra robusta. El diseño paralelo se ilustra como un diseño de tres alturas, con pozos de cristalización más altos que el puente, mientras que la disposición serial es representado como un diseño de dos alturas con pozos y derivación de igual altura. Caudales típicos fueron alrededor de 150 μL/h durante la carga, pero se observó defecto carga libre para caudales de hasta 1 mL/h en un diseño de altura tres. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 4 : In situ dispersión de luz dinámica de una cristalización bien con el tiempo. [A] microscópica imagen serie de la cristalización bien. La gota almacenada continua se contrae como vapor de agua se evapora con el tiempo. Primera microcristales de taumatina pueden observarse después de la distribución de radio hidrodinámico de correspondiente de 4 h. [B] de las partículas de la taumatina medido por DLS durante el mismo proceso de cristalización en [A]. La formación de una segunda fracción radio, indicando eventos de nucleación inicial pueden verse después de aproximadamente 1-2 h. [C] volume representativos disminución de dos volúmenes de gota de referencia debido a la pérdida de agua por evaporación con el tiempo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 5 : recopilación de datos en situ difracción. [A] chips de microfluídica individuales están montados por un adaptador 3D impreso (azul) en un goniómetro de placa. [B] taumatina cristales en la microfluídica chip durante la exposición de la radiografía como imagen por el microscopio en línea en línea P14. [C] difracción de cristales de extractos de plantas se registró a una resolución de 2.0 Å, con un insignificante bajo fondo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 6 : Evaluación de los datos de los datos de difracción de cristales de extractos de plantas en el chip de microfluidos, registrado en la temperatura ambiente. [A] densidad electrónica del modelo refinado taumatina usando el marco 1-2 conjunto de datos solamente (contorno azul en 1.5 σ). [B] decaimiento de intensidad de cristales de extractos de plantas en función de la dosis de rayos x. [C] evolución del valor Rmeas en dosis de rayos x. El cuadro de parcelas en [B] y [C] con cuartiles (valores superior 75%, mediana 50%, valores 25% inferior y medio) y bigotes con un 95% intervalos de confianza representan el decaimiento de la intensidad de difracción y Rmeas de todos los cristales expuestos (n = 83). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 7 : Distribución de orientaciones de la célula de unidad en el papel de chip de microfluidos con respecto al sistema de coordenadas de laboratorio. [A] los cristales de la taumatina bipiramidal demostraron una amplia distribución de orientaciones que abarca casi 180° en el xy-(azul), con el plano xz (verde) y plano de yz-(red). [B] isomerase de la glucosa también muestra una amplia distribución, mientras que [C] tiorredoxina mostraron una fuerte preferencia para ciertas orientaciones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Capa de SU8 Capa de vuelta Pre-cocer al horno Exponer Después de cocer al horno [65 / 95 ° C] [65 / 95 ° C] 1 capa dest : pozos 1000 RPM 0 / 10 min 200 mJ/cm2 1 / 4 min 15 μm SU8-3010 capa dend 2: derivación 2000 RPM 0 / 16 min 220 mJ / cm2 1 / 5 min 35 μm SU8-3025 3 capa derd : válvulas 3000 RPM 0 / 3 min 150 mJ / cm2 1 / 2 min. 5 μm SU8-3005 Tabla 1: ejemplo de proceso de SU8 para diseño de chip de tres capas paralelo rayos x. Este orden capa permitirá un molde PDMS de fundición para la fabricación de la viruta de la radiografía. Para molde directamente un PDMS en prototipos, invertir la capa pedidos durante la fabricación principal a partir de la 3rd terminar con la 1 capa dest en lugar de otro. Proteína Concentración de la proteína Tampón de proteínas precipitante Grupo espacio, entrada PDB Coeficiente de extinción M-1 cm-1 Taumatina (Thaumatococcus daniellii) 40 mg mL-1 mM 50 Bis-Tris, pH 6,5 1.1 tartrato de sodio de M, 50 mM Tris, pH 6.8 I4222, 1LR2 29420 Isomerase de la glucosa (Streptomyces rubiginosus) 25 mg mL-1 10 mM HEPES, 1 mM MgCl2, pH 7.0 100 mM Bis-Tris, 2.7 M sulfato de amonio, pH 5.7 I222, 4ZB2 46410 Tiorredoxina (Wuchereria bancrofti) 34 mg mL-1 20 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, 150 mM NaCl, pH 8.0 27.5% PEG1500, 100 mM de tampón con SPG, pH 6.3 P41212, 4FYU 24075 Tabla 2: Condiciones de cristalización y grupos del espacio de cristales proteicos dispuestos, incluyendo el código de coeficiente y pdb de extinción. Proteína Número de cristales expuestos Número del patrón de difracción por cristal Rango de oscilación por exposición [°] Tiempo de exposición [ms] Entrada PDB para Señor Taumatina (Thaumatococcus daniellii) 103 10 1 40 1LR2 Isomerase de la glucosa (Streptomyces rubiginosus) 69 100 0.1 80 4ZB2 Tiorredoxina (Wuchereria bancrofti) 68 10 1 40 4FYU Tabla 3: parámetro de colección datos de difracción de rayos x. Datos colección estadísticauna taumatina(Cuadro 1-20) isomerase de la glucosa (marco de 1-100) tiorredoxina(Marco de 1-10) Línea de P14 Longitud de onda [Å] 0.96863 Grupo del espacio P41212 I222 P42212 Parámetros de celda unidad: a = b, c [Å] 58.62, 151.48 93.91, 99.60, 103.04 58.45, 151.59 Número de cristales 101 41 34 Oscilación total [°] 10 10 10 Resolución [Å] 30.1.1989(1.95 – 1,89) 30.1.1975(1.80, 1.75) 30.3.2000(3.20-3.00) Temperatura [K] 296 296 296 P.i.m.Rb 7.5 (25.5) 8.8 (28.0) 9.1 (33.2) Medida reflexiones 1553200 690000 1111196 Reflexiones únicas 21850 48942 44449 I/σ(I) promedio 6.07 (1,78) 5.85 (1.66) 4.08 (1.47) MN(I) medio juego correlación CC(1/2) 96.2 (72.2) 95.8 (68,2) 97.9 (75.3) Integridad [%] 99.8 (100.0) 100.0 (99.9) 99.9 (100.0) Redundancia de 71.1 14.1 25 Estadísticas de refinamiento Rango de resolución [Å] 30/01/1989 30/01/1975 30/03/2000 R / Rgratis [%] 18.8/23.9 18.1/20.5 18.9/23.1 Átomos de la proteína 1550 3045 1129 Moléculas de agua 51 111 56° Moléculas de ligando 20 0 0 Desviación de RMS Longitud de enlace [Å] 0.02 0.026 0.01 Ángulo de enlace [°] 2.04 2.22 1.43 Factor B [Å2] Proteína 22.6 20 50 Agua 25.1 27.1 29.7 Ligand 20.4 Análisis del diagrama de Ramachandran Regiones más favorecidas [%] 97.67 95,32 96.13 Regiones permitidas [%] 2.44 4.16 3.64 Permitió generosamente regiones [%] 0.49 0,52 0.23 a: los valores entre paréntesis son para el shell de resolución más alta. b: (), donde I (hkl) es la intensidad media de la reflexiones hkl, Σhkl es la suma sobre todas las reflexiones y Σi es la suma sobre medidas de reflexión hkl. Tabla 4: Estadísticas de colección de datos de conjuntos de datos de extractos de plantas, isomerase de la glucosa y tiorredoxina. Archivo adicional 1: chip_geometry.dwg. Archivo CAD de las geometrías del chip utilizado. Haga clic aquí para descargar este archivo. Archivo adicional 2: goniometer_adapter.stl. Especifica el adaptador de goniómetro de rayos x chip de fichero STL. Haga clic aquí para descargar este archivo. Archivo adicional 3: xds.sh. Bash script para la creación de archivos de entrada para procesar cuñas de datos de difracción por XDS. Haga clic aquí para descargar este archivo. Archivo adicional 4: xscale.sh. Bash script para fusionar datos de difracción de subconjuntos y crear un archivo HKL. Haga clic aquí para descargar este archivo. Adicional-archivo 5: ISigma.sh. Bash script para extraer los valores de ISigma de todos los subconjuntos individuales. Haga clic aquí para descargar este archivo. Adicional-archivo 6: Rmeas.sh. Bash script para extraer valores de Rmeas de todos los subconjuntos individuales. Haga clic aquí para descargar este archivo. 7 de archivo adicional: rotation_matrix.sh. Bash script para preparar el archivo de entrada de Matlab calcular los ángulos de Euler de la matriz de rotación. Haga clic aquí para descargar este archivo.