Chip microfluidici per dispersione della luce dinamica In Situ diffrazione di raggi x di cristallo ed In Situ per la cristallografia seriale

Resina epossidica è un materiale di riempimento eccellente per la fabbricazione di chip di raggi x. È economico, semplice e robusta al processo senza la necessità di strumenti specializzati (Figura 1). Ridurre la viscosità della resina epossidica diluendo con etanolo al 40 wt % ha facilitato la rimozione della resina in eccesso sopra il pozzo di cristallizzazione, con conseguente definito windows di raggi x. Diluizioni di etanolo superiori ha provocato difetti in resina polimerizzata. Analizzando le sezioni trasversali di chip di raggi x, abbiamo determinato lo spessore totale finestra di entrambi i lati per essere circa 19 µm di spessore, che è molto vicino lo spessore nominale delle pellicole usate polyimide di 2 × 7,5 µm (Figura 2) Prove di cristallizzazione sono state isolate in diversi dimensioni nanolitro reazione scomparti ciascuno, utilizzando un meccanismo valvola capillare come descritto in precedenza41. Questa tecnica di caricamento ‘store-allora-creare’ evita la perdita di campione da morti-volume del canale e può facilmente essere eseguita manualmente, eliminando la necessità di utilizzare pompe o altre apparecchiature per azionamento fluido42. Il chip è innescato con olio fluorurati prima di caricare il campione acquoso. La tensione superficiale all’interfaccia acqua-olio fra olio di rabbocco e risultati campione acquoso in una differenza di pressione attraverso l’interfaccia. Questa pressione di Laplace dipende sia il raggio di curvatura e la tensione superficiale dell’interfaccia. Per ridurre al minimo la sua energia, l’interfaccia deve ridurre al minimo la superficie, che equivale a massimizzare i suoi raggi principali di curvatura a volume costante. Un’interfaccia di curvatura bassa in un canale largo ha una bassa pressione di Laplace allora un’interfaccia ad alta curvatura in un segmento di canale stretto. Pertanto, la spina di campione preferenzialmente entra e attraversa tutto il bypass canale invece che scorre attraverso le restrizioni di valvola capillare stretto. Infine, la spina di campione è seguita da olio fluorurati per separare pozzetti in goccioline indipendente. Robusto e affidabile il caricamento è stato realizzato con portate fino a 1 mL/h in entrambi, un seriale e una disposizione ben parallela (Figura 3). Nel layout ‘seriale’, ben costrizioni valvola aspirazione e capillare in sequenza sono collegati attraverso un canale di bypass31. Al contrario, nel layout ‘parallelo’, due canali principali separati collegano tutte le insenature ben o capillare valvole solo43. Entrambi i concetti di disposizione sono stati precedentemente combinati con formulazione e controllo alla composizione dello schermo, che è un aspetto utile nella proteina cristallizzazione43,44. Il design seriale ha solo due porte fluide, un ingresso e un’uscita. Ha meno liquidi porte e per questo motivo, è più semplice da costruire e operare. Il layout parallelo ha 4 porte fluide, 2 per il canale principale di collegamento pozzi e 2 per il collegamento delle valvole capillare di lasciare aria o fuga di olio in eccesso. Caricamento può quindi procedere da entrambi i lati del canale principale. Questo layout è nel complesso più basso resistenza di flusso per un numero uguale di pozzi a causa della sua esclusione più brevi. Quindi è meglio adatto per dispositivi up-regolata con un elevato numero di pozzi. Inoltre, i pozzetti sono orientata più vicino insieme, che offre vantaggi per automatizzato di imaging. Ben carico completo del campione è stato osservato per entrambi i layout, se sia costruita come un due-altezza o un disegno di tre-altezza. In un disegno di due-altezza, sia pozzetto del campione e i canali di bypass sono di uguale altezza. La progettazione di tre-altezza richiede una terza maschera, un ulteriore livello di SU8 e un passo di allineamento per garantire ulteriormente che i pozzetti dei campioni diventano più alti rispetto alla precedente bypass canali. Questo altezza-differenziale promuove la stipula di fluido campione il pozzo attraverso il capillare stesso principio che arresta il flusso alle costrizioni di valvole. Qui, il soffitto ben superiore corrisponde a una minore pressione di Laplace dell’avanzamento del menisco e di flusso lungo la direzione di bypass è favorita solo dopo wells hanno riempito completamente tale che le costrizioni di valvola bloccano ulteriormente il flusso e deviarlo verso il basso il bypass. Tuttavia, caricamento riuscito non richiede rigorosamente i pozzetti per essere superiore il bypass come valvole capillare appropriato può essere ottenuta anche regolando di conseguenza larghezze di canale. Ciò nonostante, nella nostra esperienza, i pozzi superiori eseguito significativamente più robusto e caricamento gratuito di difetto è stata osservata a volte fino a dieci portate superiori in tutti i tre-altezza disegni rispetto ai loro equivalenti di due-altezza. Questo effetto era più pronunciato in layout parallelo. Per simulare la cinetica di cristallizzazione di diffusione del vapore, la permeabilità finita della pellicola di polyimide è stata sfruttata per controllare l’evaporazione dell’acqua nel corso del tempo. Tassi di evaporazione sperimentale sono stati quantificati monitorando la variazione del volume di goccia nel tempo equiparando goccia superficie e altezza ben (Figura 4). L’evaporazione dai pozzi di cristallizzazione del chip di raggi x non procede in modo lineare, come una contrazione superficie della goccia in concomitanza con la crescente risultati di concentrazione del soluto in una velocità di evaporazione ridotta per tempo45. L’evaporazione iniziale seguita un tasso approssimativamente lineare di circa 0,5 nL h-1 in pozzetti della geometria del layout seriale. Per meglio comprendere la cinetica di cristallizzazione, liste di distribuzione sono state effettuate nei pozzetti cristallizzazione del chip microfluidici. Per misure di liste di distribuzione iniziale, un chip PDMS incollato su un vetrino è stato utilizzato per fornire migliori proprietà ottiche per l’esperimento di diffrazione della luce. Questo chip aveva le stesse dimensioni bene come il chip x-ray. PDMS ha una maggiore permeabilità al vapore acqueo di polyimide delle finestre polyimide nei raggi x chip45. Poiché il flusso scalabilità lineare con la distanza, la traiettoria di evaporazione di un polyimide con finestra ben può essere abbinata una corrispondente finestra PDMS di opportuno spessore. DLS risultati mostrano che la distribuzione di raggio cambia nel tempo (fig. 4A-B), dimostrando che le misurazioni di liste di distribuzione consentono di rilevare la nucleazione iniziale prima prime particelle cristalline sono osservate. Questa informazione può essere utilizzata per nucleazione e crescere cristalli singoli per pozzetto regolando esternamente il tasso di evaporazione e quindi la soprasaturazione livelli in una fase precoce della nucleazione46. Il chip x-ray è stato fissato su una scheda stampata 3D per il goniometro di piastra compatibile SBS presso la beamline EMBL del sincrotrone P14 a PETRA III (Figura 5A). Alternativamente, un telaio stampato 3D più piccolo può essere usato per chip di montaggio dei raggi x a standard beamline goniometri21. Taumatina cristalli hanno una dimensione di 10-20 µm (figura 5B) e diffrangono fino ad una risoluzione di 2.0 Å (Figura 5). Come previsto, il contributo di sfondo di raggi x delle due finestre di pellicole di polyimide sottile dal chip x-ray è limitato agli anelli di scattering di polyimide polimero a 11 Å (2 θ ~ 5°) e 33 Å (2 θ ~ 1,7 °) per la lunghezza d’onda dei raggi x di 0,97 Å. Questi due anelli non disturbare l’elaborazione dati. È stato raccolto un totale dataset con 83 taumatina cristalli e 10 modelli di diffrazione sono stati registrati da ogni cristallo con una rotazione di 1° durante ogni fotogramma. Elaborazione dati e parametri di raffinatezza, nonché le statistiche del dataset taumatina sono elencate e confrontate con due altri DataSet dell’isomerasi del glucosio e thioredoxin che erano anche raccolti in situ sono elencati in tabella 3 e Tabella 4. Il decadimento di intensità della potenza normalizzata diffrazione nel corso del tempo è stato studiato scindendo il dataset taumatina nei cinque sub DataSet (due modelli di diffrazione sono stati utilizzati al sottoinsieme di mantenere completa di set di dati). Come mostrato in Figura 6B, il potere di diffrazione ha cominciato a diminuire dopo il primo set di dati di sub ed era inferiore al 50% nel quarto sub dataset. Di conseguenza, i valori di Rmeas dei DataSet sub sono anche aumentando nel tempo, che indica il danno da radiazione a raggi x durante la raccolta dei dati. Supponiamo che i radicali liberi generati durante l’esposizione ai raggi x rapidamente degradare cristalli vicini nello stesso contenitore di reazione. Ad esempio, tali danni secondari di raggi x è stato che meno pronunciato in un approccio sperimentale correlato, dove i cristalli sono stati distribuiti su una superficie significativamente maggiore in un panino di polyimide21. Per minimizzare il danno complessivo di raggi x, solo un piccolo numero di modelli di diffrazione da un cristallo particolare deve essere raccolti a temperatura ambiente. Inoltre, solo un singolo cristallo di singola proteina deve essere esposto per vano del chip microfluidici. Tuttavia, tutti i modelli di struttura raffinati utilizzando i set di dati elaborati mostrano stereochimica molto buono e adatto alle statistiche (tabella 4). Inoltre, tutte le mappe di densità dell’elettrone finale erano di qualità molto buona. In precedenti approcci di cristallografia sui chip trasparente ai raggi x, l’orientamento e la disposizione dei cristalli ha dovuto essere deliberatamente manipolato per ottenere una distribuzione casuale di cristallo orientamenti40 o è stata ottenuta dai movimenti di cristallo all’interno del liquido livello21. Per valutare l’orientamento di cristallo nei raggi x trasparente microfluidic chip descritto in questo protocollo, è stato determinato l’orientamento della cella unità di tutti i cristalli esposti per quanto riguarda il sistema di coordinate di laboratorio. Per i cristalli bipiramidali taumatina, una leggera preferenza è stata osservata (figura 7A), mentre abbiamo ottenuto un’ampia distribuzione di cristalli di glucosio isomerasi (figura 7B). Abbiamo ragionato che su scala nanometrica, maggior parte dei materiali presentano rugosità significativa. Quindi, cristalli spontaneamente potrebbero nucleano sulla superficie in significativamente meno prevenuti orientamenti spontaneamente. Tale nucleo di un piccolo cristallo può essere bloccato in un orientamento, pur continuando a crescere fino a dimensioni appropriate senza riorientamento rispetto alla normale della superficie. Infatti, nucleazione superficie mediato del cristallo è da sempre un fastidio per cristallografi cercando a ciclo continuo un cristallo allegato alla superficie senza danneggiare il cristallo nel processo. Qui, possiamo utilizzare direttamente tali cristalli per la raccolta di dati di diffrazione. Esistono tuttavia limitazioni specifiche del sistema, come la tioredossina ha rivelato una forte preferenza per determinati orientamenti in xy, xz e yz-aerei (Figura 7). Gli esempi hanno mostrati dimostrano che la distribuzione di orientamento non dipende soltanto l’ambiente di crescita ma anche la forma di cristallo. I cristalli di thioredoxin hanno allungato forme che tendono a crescere in orientamento preferito, mentre i cristalli di taumatina tetragonale bipiramidali o i cristalli di isomerasi del glucosio ortorombico non mostrano questo comportamento. Tuttavia, in tutti i casi, anche con comodo orientamenti che della gamma accessibile di rotazioni di cristallo ha provocata sufficientemente buona copertura di spazio reciproco e quindi completo set di dati per tutti studiato proteine. Così, ulteriori misure non ha dovuto essere presa quando seleziona i cristalli per l’esposizione dei raggi x. Figura 1 : Schema di microfluidica fabbricazione di chip di raggi x. (1) SU-8 viene erogato su un substrato di silicio e spin rivestito per ottenere lo spessore desiderato. (2) Photoresist è esposto ai raggi UV attraverso una maschera. (3) non esposti photoresist è quindi sviluppato via lavando consecutivamente con PGMEA e isopropanolo, conseguente (4) un master SU-8 per la colata di ulteriori passi. (5) PDMS è versato sulla, e (6) dopo indurimento dello stampo PDMS, è sbucciata dal Maestro SU-8. colla epossidica (7a) viene erogata sullo stampo PDMS e (7b) una pellicola di polyimide attivato è chimicamente legato alla resina epossidica. (8) dopo l’indurimento, la pellicola di polyimide con il film di fantasia sottile a resina epossidica è sbucciata dallo stampo PDMS. (9) in una fase finale, il dispositivo è con coperchio con un secondo foglio di polyimide per produrre un chip della microfluidica recintato di sfondo di raggi x basso. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2 : Fotografia (a sinistra) e microscopia immagini di sezioni trasversali dei chip finale. Un segmento di canale rappresentativo (al centro) e un pozzo di cristallizzazione (a destra) da due chip separati sono mostrati. Le frecce indicano le distanze misurate. Tutte le dimensioni sono espresse in µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3 : Schemi di cristallizzazione ben progetta con [A] parallelo o seriale layout di [B], come hanno visto dall’alto e dal lato, con le misure indicate in µm. Altezze di canale tipici erano: bypassare il 50 µm, 50-60 µm cristallizzazione ben, 5-10 µm valvola capillare, corrispondenti a ben volumi di circa 2,5 nL (layout parallelo) e 8 nL (seriale layout). Rappresentante anche il comportamento di caricamento viene mostrato con coloranti alimentari. Il chip è stato innescato con 12 wt % 1H, 1 H, 2H, 2h-perfluoro-1-ottanolo in FC-43, prima di colorante alimentare è stato iniettato nei pozzetti di deposito. Frecce bianche indicano la direzione del flusso. Foto panoramica di show di dispositivi caricati tutti i pozzetti caricati difetto di caricamento del campione robusto libero, illustrando. Il layout parallelo è illustrato come un disegno di tre-altezza, con pozzi di cristallizzazione superiore il bypass, mentre il layout seriale è raffigurato come un disegno di due-altezza con pozzi e bypass aventi uguale altezza. Portate tipiche sono stati circa 150 µ l/h durante il caricamento, ma caricamento gratuito di difetto è stata osservata per portate fino a 1 mL/h in un disegno tre di altezza. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 4 : In situ Dynamic Light Scattering di una cristallizzazione bene nel tempo. [A] serie di immagini microscopica della cristallizzazione ben. La gocciolina stored continua si restringe come vapore acqueo evapora nel tempo. Prima taumatina microcristalli possono essere osservato dopo la distribuzione di 4 h. [B] corrispondente raggio idrodinamico delle particelle taumatina misurata da liste di distribuzione durante il processo di cristallizzazione stessa fotografato in [A]. La formazione di una frazione di secondo raggio, che indica gli eventi di nucleazione iniziale possono essere visto dopo volume rappresentativo di circa 1-2 h. [C] diminuire di due volumi di gocciolina di riferimento a causa della perdita di acqua per evaporazione nel tempo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 5 : in situ raccolta di dati di diffrazione. [A] chip microfluidici individuali sono montati da una scheda stampata 3D (blu) su un goniometro di piastra. [B] taumatina cristalli nel microfluidic chip durante l’esposizione ai raggi x come imaged dal microscopio in linea alle beamline P14. [C] diffrazione dei cristalli taumatina è stato registrato a una risoluzione di 2.0 Å, con un background minimo trascurabile. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 6 : Valutazione di dati di dati di diffrazione da taumatina cristalli nel chip microfluidici, registrata a temperatura ambiente-. [A] densità elettronica del modello raffinato taumatina utilizzando il telaio 1-2 set di dati solo (blu contorni a 1.5 σ). [B] decadimento di intensità di taumatina cristalli in funzione della dose di raggi x. [C] l’evoluzione del valore Rmeas sopra la dose di raggi x. La casella di terreni a [B] e [C] con quartili (valori superiori 75%, valori mediani 50%, valori 25% inferiore e medio) e baffi con 95% gli intervalli di confidenza rappresentano il decadimento dell’intensità di diffrazione e Rmeas di tutti i cristalli esposti (n = 83). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 7 : Distribuzione di orientamenti di cella di unità nell’estruso chip microfluidici per quanto riguarda il sistema di coordinate di laboratorio. [A] cristalli bipiramidali taumatina ha mostrato un’ampia distribuzione di orientamenti che copre quasi 180° in xy-(blu), piano XZ (verde) e il yz-(red) aereo. [B] isomerasi del glucosio Mostra anche una distribuzione ad ampio raggio, mentre [C] thioredoxin ha mostrato una forte preferenza per determinati orientamenti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. SU8-strato Cappotto di spin Pre-cuocere Esporre Post-cuocere [65 / 95 ° C] [65 / 95 ° C] 1 strato dist : Wells 1000 GIRI/MIN 0 / 10 min 200 mJ/cm2 1 / 4 min 15 µm SU8-3010 2nd strato: Bypass 2000 GIRI/MIN 0 / 16 min 220 mJ / cm2 1 / 5 min 35 µm SU8-3025 3rd strato: valvole 3000 GIRI/MIN 0 / 3 min 150 mJ / cm2 1 / 2 min 5 µm SU8-3005 Tabella 1: esempio di processo SU8 per la progettazione dei chip di tre-strato parallelo raggi x. Questo strato ordine permetterà per casting uno stampo PDMS per fabbricazione di chip di raggi x. Per modellare direttamente un PDMS durante la prototipazione, invertire lo strato ordine durante la fabbricazione master a dai 3rd dall’inizio alla fine con 1 strato dist invece. Proteina Concentrazione nella proteina Buffer della proteina precipitante Gruppo dello spazio, voce PDB Coefficiente di estinzione [M-1 cm-1] Taumatina (Thaumatococcus daniellii) 40 mg mL-1 50 mM Bis-Tris, pH 6.5 1.1 tartrato di sodio e M, 50 mM Tris, pH 6.8 I4222, 1LR2 29420 Isomerasi del glucosio (Streptomyces rubiginosus) 25 mg mL-1 10 mM HEPES, 1 mM MgCl2, pH 7.0 100 mM Bis-Tris, solfato di ammonio di 2,7 M, pH 5,7 I222, 4ZB2 46410 Thioredoxin (Wuchereria bancrofti) 34 mg mL-1 20 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, 150 mM NaCl, pH 8.0 27,5% PEG1500, 100 mM SPG tampone, pH 6.3 P41212, 4FYU 24075 Tabella 2: Condizioni di cristallizzazione e gruppi dello spazio di cristalli di proteine preparati, tra cui il codice di coefficiente e pdb di estinzione. Proteina Numero di esposti cristalli Numero di modello di diffrazione a cristallo Gamma di oscillazione per esposizione [°] Tempo di esposizione [ms] Voce PDB per MR Taumatina (Thaumatococcus daniellii) 103 10 1 40 1LR2 Isomerasi del glucosio (Streptomyces rubiginosus) 69 100 0.1 80 4ZB2 Thioredoxin (Wuchereria bancrofti) 68 10 1 40 4FYU Tabella 3: diffrazione di raggi x parametro di raccolta dati. Dati raccolta statisticheun taumatina(Fotogramma 1-20) isomerasi del glucosio (telaio 1-100) tioredossina(Telaio 1-10) Beamline P14 Lunghezza d’onda [Å] 0.96863 Gruppo spaziale P41212 I222 P42212 Parametri di cella centrale: un = b, c [Å] 58.62, 151.48 93.91, 99.60, 103,04 58.45, 151.59 Numero di cristalli 101 41 34 Totale di oscillazione [°] 10 10 10 Risoluzione [Å] 30.1.1989(1.95 – 1,89) 30.1.1975(1,80 – 1,75) 30.3.2000(3.20 – 3.00) Temperatura [K] 296 296 296 R p.i.mb 7.5 (25,5) 8.8 (28,0) 9.1 (33,2) Riflessioni misurati 1553200 690000 1111196 Riflessi unici 21850 48942 44449 Medio I/σ(I) 6,07 (1,78) 5,85 (1.66) 4,08 (1,47) MN(I) set di metà correlazione CC(1/2) 96,2 (72,2) 95,8 (68,2) 97,9 (75,3) Completezza [%] 99.8 (100.0) 100.0 (99.9) 99.9 (100.0) Ridondanza 71,1 14.1 25 Statistiche di raffinatezza Gamma di risoluzioni [Å] 30/01/1989 30/01/1975 30/03/2000 R / Rgratis [%] 18.8/23.9 18.1/20.5 18.9/23.1 Atomi della proteina 1550 3045 1129 Molecole di acqua 51 111 164 Molecole leganti 20 0 0 Deviazione di RMS Lunghezza di legame [Å] 0,02 0,026 0,01 Angolo di legame [°] 2.04 2.22 1.43 Fattore B [Å2] Proteina 22,6 20 50 Acqua 25,1 27.1 29,7 Ligando 20,4 Analisi del diagramma di Ramachandran Regioni più favorite [%] 97,67 95,32 96,13 Regioni ammessi [%] 2,44 4,16 3.64 Generosamente ammessi regioni [%] 0,49 0,52 0.23 r: i valori tra parentesi sono per la shell di risoluzione più alta. b: (), dove ho (hkl) è l’intensità media dell’hkl riflessioni, Σhkl è la somma sopra tutte le riflessioni e Σi è la somma oltre i misure di riflessione hkl. Tabella 4: Statistiche di raccolta dei dati del set di dati da taumatina, isomerasi del glucosio e thioredoxin. 1 complementare-File: chip_geometry.dwg. File CAD delle geometrie chip utilizzato. Per favore clicca qui per scaricare questo file. Complementare-File 2: goniometer_adapter.stl. STL-file specificando l’adattatore del goniometro chip dei raggi x. Per favore clicca qui per scaricare questo file. 3 complementare-File: xds.sh. Bash script per la creazione di file di input per elaborare zeppe di dati di diffrazione di XDS. Per favore clicca qui per scaricare questo file. 4 complementare-File: xscale.sh. Bash script per unire i dati di diffrazione da sottoinsiemi e creare un file HKL. Per favore clicca qui per scaricare questo file. Complementare-File 5: ISigma.sh. Bash script per estrarre i valori di ISigma da tutti i singoli sottogruppi. Per favore clicca qui per scaricare questo file. Complementare-File 6: Rmeas.sh. Bash script per estrarre i valori Rmeas da tutti i singoli sottogruppi. Per favore clicca qui per scaricare questo file. 7 complementare-File: rotation_matrix.sh. Bash script per preparare il file di input per Matlab calcolare gli angoli di Eulero dalla matrice di rotazione. Per favore clicca qui per scaricare questo file.