Chips microfluídicos por difração de raio x de cristal In Situ e In Situ Difusão dinâmica da luz de cristalografia de Serial

Epóxi é um material de enchimento excelente para fabricação de chip de raio-x. É barato, simples e robusto para o processo, sem a necessidade de ferramentas especializadas (Figura 1). Reduzir a viscosidade da cola epoxy diluindo-a com 40 wt % de etanol facilitou a remoção do excesso de resina acima do poço de cristalização, resultando em windows definidos de raio-x. Diluições de etanol superiores resultaram em defeitos na resina curada. Através da análise de secções transversais de microplaqueta do raio-x, determinamos a espessura total da janela de ambos os lados para ser aproximadamente 19 µm de espessura, que é muito próximo a espessura nominal das películas de poliimida usado de 2 × 7,5 µm (Figura 2) Ensaios de cristalização foram isolados em vários nanolitros tamanho reação compartimentos cada, usando um mecanismo de válvula capilar, conforme descrito anteriormente,41. Esta técnica de carregamento ‘loja-então-criar’ evita a perda de amostra de mortos-volume do canal e pode facilmente ser executada manualmente, eliminando a necessidade de usar bombas ou outros equipamentos para atuação fluido42. O chip é preparado com óleo fluorado antes de carregar a amostra aquosa. A tensão superficial na interface entre óleo de escorva e amostra aquosa resulta em uma diferença de pressão através da interface óleo-água. Esta pressão de Laplace depende tanto o raio de curvatura e a tensão superficial da interface. Para minimizar sua energia, a interface deve minimizar a sua superfície, que é equivalente a maximizar seus principais raios de curvatura no volume constante. Uma interface de curvatura baixo em um canal de largura tem uma pressão mais baixa de Laplace, em seguida, uma interface de curvatura alta em um segmento de canal estreito. Portanto, a tomada de amostra preferencialmente entra e flui através de toda a ignorar o canal ao invés de fluir através de restrições a estreita válvula capilar. Finalmente, a tomada de amostra é seguida por óleo fluorado para separar os poços da amostra em gotículas independentes. Robusto e confiável de carregamento foi alcançado com vazões de até 1 mL/h em ambos, uma série e um arranjo bem paralelo (Figura 3). No layout ‘serial’, bem constrições de válvula de admissão e capilar são sequencialmente conectadas através de um canal de desvio de31. Em contraste, no layout ‘paralelo’, dois canais separados de principais conectar todas as entradas bem ou capilar válvulas apenas43. Ambos os conceitos de arranjo tem sido previamente combinados com controle de formulação para a composição da tela, que é um aspecto útil na proteína cristalização43,44. O projeto de série tem apenas duas portas fluidas, uma entrada e uma saída. Tem menos líquidos portos e devido a isso, é mais simples de construir e operar. O layout paralelo tem 4 portas fluidas, 2 para o canal principal conectando os poços e 2 para interligar as válvulas capilares para deixar o ar ou fuga de óleo em excesso. Carga possa prosseguir, portanto, de ambos os lados do canal principal. Este layout em geral tem menor resistência de fluxo para um número igual de poços, devido ao seu menor desvio. Portanto, melhor é adequado para dispositivos dimensionado para cima com um elevado número de poços. Além disso, os poços de amostra são orientados mais perto junto, que oferece vantagens para automatizada de imagem. Exemplo completo bem a carregar foi observado para ambos os layouts, se também construído como uma dois-altura ou um design de três de altura. Em um projeto de dois-altura, ambos bem a amostra e os canais de desvio são da altura igual. O design de três de altura requer uma terceira máscara, uma camada adicional de SU8 e um passo de alinhamento para continuar a garantir que os poços da amostra se tornar maiores do que o anterior desvio de canais. Este diferencial de altura promove entrando de fluido de amostra do poço através do capilar mesmo princípio que impede o fluxo para as constrições de válvulas. Aqui, o teto bem mais elevado corresponde a uma menor pressão de Laplace do avanço do menisco e fluxo ao longo da direção de desvio é favorecida somente depois de poços têm preenchido completamente tal que as constrições de válvula bloqueiam mais fluxo e desviá-lo para baixo o bypass. No entanto, carregamento bem sucedido não requer estritamente os poços mais elevados do que o bypass como válvulas capilar apropriado também podem ser alcançado ajustando larguras de canal em conformidade. No entanto, em nossa experiência, poços de maior realizada significativamente mais robusto e carregamento gratuito de defeito foi observado em até dez vezes caudais mais elevados em todos os designs de três de altura em comparação com seus equivalentes do dois-altura. Este efeito foi mais pronunciado no layout paralelo. Para simular a cinética de cristalização de difusão de vapor, a permeabilidade finita da película de poliimida foi explorada para controlar a evaporação da água ao longo do tempo. Taxas de evaporação experimental foram quantificadas através do monitoramento a mudança do volume da gota ao longo do tempo, igualando a área de superfície de gota e altura bem (Figura 4). A evaporação dos poços de cristalização no chip de raio-x não proceder de forma linear, como uma área de superfície de encolhimento da gota coincidindo com o aumento de resultados de concentração de soluto em uma taxa de evaporação reduzida ao longo do tempo,45. A evaporação inicial seguiu-se uma taxa de aproximadamente linear de sobre 0,5 nL h-1 em poços da geometria do layout serial. Para entender melhor a cinética de cristalização, foram realizadas medidas de DLS em poços de cristalização do chip microfluidic. Para medições de DLS iniciais, um chip PDMS colado sobre uma lâmina de vidro foi usado para fornecer melhor propriedades ópticas para o experimento de espalhamento de luz. Este chip tinha as mesmas dimensões bem como a troca de raio-x. PDMS tem uma maior permeabilidade do vapor de água do que a poliamida das janelas poliimida nos raios-x chip45. Desde que o fluxo escala linearmente com a distância, a trajetória de evaporação de uma poliimida em janelas bem pode ser combinada com uma janela PDMS correspondente de espessura apropriada. DLS resultados mostram que a distribuição de raio muda ao longo do tempo (Figura 4A-B), demonstrando que as medições de DLS permitem para detectar a nucleação inicial antes de primeiras partículas cristalinas são observadas. Esta informação pode ser usada para nucleate e crescer cristais por alvéolo, externamente, ajustando a taxa de evaporação e, portanto, níveis de supersaturação na fase inicial da nucleação46. O chip de raio-x foi fixado em um adaptador 3D impresso para o goniômetro de placa compatível SBS na trajetória EMBL do síncrotron P14 em PETRA III (Figura 5A). Alternativamente, um menor quadro impresso 3D pode ser usado para fichas de raio-x do monte a trajetória padrão goniómetro21. Taumatina cristais têm um tamanho de 10-20 µm (Figura 5B) e difração até uma resolução de 2.0 Å (Figura 5). Como esperado, a contribuição do fundo de raio-x das duas janelas folhas finas poliimida do chip raio-x é limitada para anéis de dispersão de polímero de poliamida 11 Å (2 θ ~ 5°) e 33 Å (2 θ ~ 1,7 °) para o comprimento de onda de raio-x de 0,97 Å. Estes dois anéis não perturbe o processamento de dados. Foi coletado um total dataset com 83 Taumatina cristais e 10 padrões de difração foram registrados de cada cristal com uma rotação de 1° durante cada quadro. Processamento de dados e parâmetros de refinamento, bem como as estatísticas da Taumatina dataset são listadas e comparadas com dois outros conjuntos de dados de isomerase de glicose e tioredoxina também foram coletados em situ estão listados na tabela 3 e Tabela 4. O decaimento de intensidade do poder de difração normalizado ao longo do tempo foi investigado por separar o dataset Taumatina em cinco conjuntos de dados sub (dois padrões de difração foram usados por subconjunto para manter conjuntos de dados completos). Como mostrado na Figura 6B, o poder de difração começou a diminuir após o primeiro conjunto de dados sub e estava abaixo de 50% no quarto sub dataset. Como resultado, os valores de Rmeas de sub conjuntos de dados também estão aumentando ao longo do tempo, indicando os danos de radiação de raio-x durante a coleta de dados. Nós hypothesize que os radicais livres gerados durante a exposição de raios-x rapidamente degradam cristais vizinhos no mesmo compartimento reação. Por exemplo, tais danos secundários de raio-x foram que menos pronunciada em uma abordagem experimental relacionada, onde cristais foram distribuídos sobre uma área significativamente maior em um sanduíche de poliimida21. Para minimizar os danos de raios-x gerais, apenas um pequeno número de padrões de difração de um cristal específico deverão ser recolhido à temperatura ambiente. Além disso, apenas um cristal único de proteína deve ser exposto por compartimento do chip microfluidic. No entanto, todos os modelos de estrutura refinados usando os conjuntos de dados processados mostram muito bom estereoquímica e estatísticas adequadas (tabela 4). Além disso, todos os mapas de densidade de elétrons final foram de muito boa qualidade. Em abordagens anteriores de cristalografia em chips transparentes de raio-x, a orientação e o arranjo dos cristais tinha que ser manipulado deliberadamente para obter uma distribuição aleatória de cristal orientações40 ou foi obtido por movimentos de cristal dentro da camada líquida de21. Para avaliar a orientação de cristal nos chips microfluídicos transparente raio x descrito neste protocolo, determinou-se a orientação de célula de unidade de todos os cristais expostos em relação ao sistema de coordenadas de laboratório. Os cristais de Taumatina dihexagonal, uma ligeira preferência foi observada (Figura 7A), enquanto que obtivemos uma ampla distribuição de cristais de glicose isomerase (Figura 7B). Nós raciocinou que na escala de nanômetros, a maioria dos materiais apresentam aspereza significativa. Daí, cristais espontaneamente poderiam nucleada na superfície em significativamente menos tendenciosas orientações espontaneamente. Tal um núcleo de cristal pequeno pode ser bloqueado em uma orientação, continuando a crescer para o tamanho adequado sem reorientação em relação a normal da superfície. Na verdade, nucleação de cristal mediada por superfície tem sido um incômodo para tentar um cristal anexado a superfície de um loop sem danificar o cristal no processo de crystallographers. Aqui, nós podemos utilizar diretamente tais cristais para coleta de dados de difração. No entanto, existem limitações específicas do sistema, como a tioredoxina revelou uma forte preferência por determinadas orientações no xy, xz e yz-aviões (Figura 7). Os exemplos que mostrou demonstram que a distribuição de orientação não depende apenas do ambiente de crescimento, mas também na forma de cristal. Os cristais de tioredoxina tem alongado formas que tendem a crescer na orientação preferencial, enquanto os cristais de Taumatina dihexagonal tetragonal ou cristais ortorrômbico glicose isomerase não mostram esse comportamento. No entanto, em todos os casos, mesmo com orientações preferenciais que a gama acessível de rotações de cristal resultou em suficientemente boa cobertura de espaço recíproco e, portanto, completa de conjuntos de dados para todos os investigados proteínas. Assim, sem medidas adicionais tinham que ser levado ao selecionar os cristais para a exposição de raio-x. Figura 1 : Regime de microfluidic fabricação de chip de raio-x. (1) SU-8 é dispensado em um substrato de silício e spin revestido para obter a espessura desejada. (2) fotorresiste é exposta à radiação UV através de uma máscara. (3) unexposed fotorresiste é então desenvolvido fora lavando consecutivamente com PGMEA e isopropanol, resultando em (4) um mestre de SU-8 para lançar ainda mais passos. (5) PDMS é derramado sobre, e (6) após o molde PDMS, cura é descascado do mestre SU-8. cola de epóxi (7a) é dispensada sobre o molde PDMS e (7b) é de uma folha de poliimida ativado quimicamente ligado à resina epóxi. (8) após a cura, a folha de poliimida com o filme de cola epoxy fina padronizada é descascada do molde PDMS. (9) em uma etapa final, o dispositivo é pálpebras com uma segunda folha de poliimida para produzir um chip fechado em baixa raio x microfluidic de fundo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2 : Fotografia (à esquerda) e imagens de microscopia de seções transversais dos chips finais. Um segmento de canal representativo (médio) e um poco de cristalização (à direita) de dois chips separados são mostrados. As setas indicam a medida de distâncias. Todas as dimensões estão em µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3 : Planta da cristalização bem projeta com [A] paralelo ou serial layout de [B], visto de cima e do lado, com as dimensões indicadas em µm. Alturas de canal típico foram: bypass de 50 µm, 50-60 µm cristalização bem, 5-10 µm válvula capilar, correspondente ao bem volumes de cerca de 2,5 nL (disposição paralela) e 8 nL (layout de serial). Representante bem carregando o comportamento é mostrado usando corantes alimentares. O chip foi aprontado com 12 wt % 1H, 1 H, 2H, 2H-perfluoro-1-octanol no FC-43, antes de corante de comida foi injetado em poços de armazenamento. As setas brancas indicam a direção do fluxo. Imagens de visão do show de dispositivos carregados todos os poços carregados de defeitos carregamento livre, ilustrando amostra robusta. O layout paralelo é ilustrado como um projeto de três de altura, com poços de cristalização mais elevados do que o bypass, enquanto o layout serial é retratado como um projeto de dois-altura com poços e ignorar ter altura igual. Taxas de fluxo típico foram cerca de 150 µ l/h durante o carregamento, mas defeito carregamento gratuito foi observado para vazões de até 1 mL/h em uma altura de três-design. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4 : In situ Difusão dinâmica da luz de uma cristalização bem ao longo do tempo. [A] microscópico imagem série de bem a cristalização. A gota armazenada contínua encolhe como vapor de água que evapora ao longo do tempo. Primeiro Taumatina microcristais podem ser observados após a distribuição de raio hidrodinâmico 4 h. [B] correspondentes das partículas Taumatina medido por DLS durante o processo de cristalização mesmo fotografado em [A]. A formação de uma segunda fração do raio, indicando eventos de nucleação inicial podem ser vistos depois de aproximadamente volume representativo de 1-2 h.. [C] redução de dois volumes de gotículas de referência devido à perda de água por evaporação ao longo do tempo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 5 : coleta de dados em situ difração. [A] individuais microfluidic fichas são montadas por um adaptador 3D impresso (azul) em um goniômetro de placa. [B] Taumatina cristais no microfluidic chip durante a exposição de raios-x como descoberto pelo microscópio em linha na trajetória P14. [C] difração de Taumatina cristais foi gravada para uma resolução de 2.0 Å, com um insignificante baixo fundo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 6 : Avaliação de dados de dados de difração de cristais de Taumatina no chip microfluídicos, gravado na sala-temperatura. [A] densidade do elétron do modelo Taumatina refinado usando o quadro 1-2 conjunto de dados apenas (contornos azuis no 1.5 σ). [B] decaimento de a intensidade dos cristais Taumatina em função da dose de raios-x. [C] evolução do valor Rmeas sobre dose de raios-x. A caixa de terrenos em [B] e [C] com quartis (valores superior 75%, valores medianos 50%, mais baixos valores 25% e média) e bigodes com 95% intervalos de confiança representam a decadência da intensidade da difração e Rmeas de todos os cristais expostos (n = 83). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 7 : Distribuição de orientações de célula unidade na folha de microplaqueta microfluidic em relação ao sistema de coordenadas laboratório. [A] dihexagonal Taumatina cristais mostrou uma ampla distribuição de orientações cobrindo quase 180° no xy – (azul), plano xz (verde) e plano de yz-(red). [B] isomerase glucose também mostra uma distribuição ampla, enquanto [C] tioredoxina mostrou uma forte preferência por determinadas orientações. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. SU8-camada Casaco de rotação Pré-cozer Expor Pós-coza [65 / 95 ° C] [65 / 95 ° C] 1 camada dest : poços 1000 RPM 0 / 10 min 200 mJ/cm2 1 / 4 min SU8 de 15 µm-3010 camada 2nd : Bypass 2000RPM 0 / 16 min 220 mJ / cm2 1 / 5 min SU8 de 35 µm-3025 3 camada derd : válvulas 3000 RPM 0 / 3 min 150 mJ / cm2 1 / 2 min 5 µm SU8-3005 Tabela 1: exemplo de processo de SU8 para o projeto de microplaqueta de raio-x paralelo da três-camada. Essa camada ordem permitirá para fundição de um molde PDMS para a fabricação de chip de raio-x. Para moldar diretamente um PDMS durante prototipagem, inverta a camada ordenando durante a fabricação do mestre para iniciar a partir do 3rd para terminar com ast 1 camada em vez disso. Proteína Concentração de proteína Tampão de proteína precipitantes Grupo de espaço, entrada do PDB Coeficiente de extinção [M-1 cm-1] Taumatina (Thaumatococcus daniellii) 40 mg mL-1 50 mM Tris-Bis, pH 6.5 1.1 tartarato de sódio e M, 50 mM Tris, pH 6,8 I4222, 1LR2 29420 Isomerase de glicose (Streptomyces rubiginosus) 25 mg mL-1 10 mM HEPES, 1 mM MgCl2, pH 7.0 100 mM Tris-Bis, sulfato de amônio de 2,7 M, pH 5,7 I222, 4ZB2 46410 Tioredoxina (Wuchereria bancrofti) 34 mg mL-1 20 mM, 5 mM EDTA, 150 mM NaCl, Tris-HCl, pH 8,0 27,5% PEG1500, 100mm SPG buffer, pH 6.3 P41212, 4FYU 24075 Tabela 2: Condições de cristalização e espaço grupos de cristais de proteína preparados, incluindo o código de coeficiente e pdb de extinção. Proteína Número de cristais expostos Número de padrão de difração por cristal Intervalo de oscilação por exposição [°] Tempo de exposição [ms] Entrada PDB para senhor Taumatina (Thaumatococcus daniellii) 103 10 1 40 1LR2 Isomerase de glicose (Streptomyces rubiginosus) 69 100 0.1 80 4ZB2 Tioredoxina (Wuchereria bancrofti) 68 10 1 40 4FYU Tabela 3: difração de raios x parâmetro de coleta de dados. Dados coleção estatísticasum Taumatina(Quadro 1-20) isomerase de glicose (quadro 1-100) tioredoxina(Quadro 1-10) Beamline P14 Comprimento de onda [Å] 0.96863 Grupo de espaço P41212 I222 P42212 Parâmetros de célula unidade: a = b, c [Å] 58.62, 151.48 93.91, 99.60, 103.04 58.45, 151.59 Número de cristais 101 41 34 Oscilação total [°] 10 10 10 Resolução [Å] 30.1.1989(1,95 – 1.89) 30.1.1975(1,80 – 1,75) 30.3.2000(3.20-3,00) Temperatura [K] 296 296 296 R p.i.m.b 7.5 (25,5) 8.8 (28.0) 9.1 (33.2) Reflexões medidos 1553200 690000 1111196 Reflexões exclusivos 21850 48942 44449 I/σ(I) média 6,07 (1.78) 5.85 (1.66) 4,08 (1.47) MN(I) meia-conjunto correlação CC(1/2) 96.2 (72,2) 95.8 (68,2) 97.9 (75,3) Completude [%] 99.8 (100.0) 100.0 (99,9) 99,9 (100.0) Redundância 71,1 14.1 25 Estatísticas de refinamento Gama de resolução [Å] 30/01/1989 30/01/1975 30/03/2000 R / Rlivre [%] 18.8/23.9 18.1/20.5 18.9/23.1 Átomos da proteína 1550 3045 1129 Moléculas de água 51 111 56° Moléculas de ligante 20 0 0 Desvio RMS Bond-comprimento [Å] 0.02 0,026 0.01 Ângulo de ligação [°] 2,04 2.22 1,43 Fator B [Å2] Proteína 22.6 20 50 Água 25,1 27.1 29,7 Ligante 20,4 Análise do enredo de robalo Regiões mais favorecidas [%] 97.67 95.32 96.13 Regiões permitidas [%] 2,44 4.16 3,64 Generosamente permitiu regiões [%] 0,49 0,52 0.23 r: os valores entre parênteses são para o shell de resolução mais alta. b: (), onde eu (hkl) é a intensidade média da hkl reflexões, Σhkl é a soma sobre todas as reflexões e Σi é a soma mais eu medições de reflexão hkl. Tabela 4: Estatísticas de coleta de dados de conjuntos de dados de Taumatina, isomerase de glicose e tioredoxina. Complementar-arquivo 1: chip_geometry.dwg. CAD-arquivo das geometrias chip usado. Clique aqui para baixar este arquivo. Complementar-arquivo 2: goniometer_adapter.stl. STL-arquivo especificando o adaptador de goniômetro de microplaqueta de raio-x. Clique aqui para baixar este arquivo. 3 complementar-arquivo: xds.sh. Bash script para criar arquivos de entrada para processar cunhas de dados de difração por XDS. Clique aqui para baixar este arquivo. 4 complementar-arquivo: xscale.sh. Bash script para mesclar dados de difração de subconjuntos e criar um arquivo HKL. Clique aqui para baixar este arquivo. Complementar-arquivo 5: ISigma.sh. Bash script para extrair os valores de ISigma de todos os subconjuntos individuais. Clique aqui para baixar este arquivo. Complementar-arquivo 6: Rmeas.sh. Bash script para extrair valores de Rmeas de todos os subconjuntos individuais. Clique aqui para baixar este arquivo. 7 complementar-arquivo: rotation_matrix.sh. Bash script para preparar o arquivo de entrada para Matlab calcular os ângulos de Euler da matriz de rotação. Clique aqui para baixar este arquivo.