Disección señalización complejos por purificación de la afinidad de complementación Bimolecular (BiCAP)

Conjunto complejo de proteínas es un proceso clave en el mantenimiento de la especificidad espaciotemporal de muchos señalización vías^1,2. Mientras que la naturaleza crítica de esta función reguladora es ampliamente reconocida, hay una falta de técnicas experimentales para estudiar estos complejos. La mayoría interactómica estudios se centran en las interacciones con las proteínas individuales, o el enriquecimiento secuencial de componentes complejos. Presentamos aquí una técnica para el aislamiento de un dímero de la proteína específica mientras que excluyendo las moléculas individuales de la componente de proteínas así como complejos formados con competencia vinculante socios³. Hemos llamado a esta técnica de purificación de afinidad de complementación Bimolecular (BiCAP), ya que es una combinación de un ensayo de complementación de fragmento de previamente existente proteína, complementación Bimolecular de la fluorescencia (centro), con el uso nuevo de un conformación específica nanobody recombinante GFP y sus derivados (ver tabla de materiales).

Un ensayo de complementación de fragmento de proteína típica se basa en la expresión de proteínas “presa” y el “cebo” fundido para dividir fragmentos de reporteros como luciferase⁴, β-galactosidasa⁵o proteína fluorescente verde (GFP)⁶ ( Figura 1A). A través de la interacción de las proteínas cebo y presa, los dominios de reportero de split se anima a doblar en una estructura funcional, que permiten la interacción del cebo y presa de proteínas para ser visualizado o cuantificado. BiCAP fue adaptado de una versión de esta técnica que hace uso de fragmentos de la variante de la GFP Venus. Ensayos de complementación de proteínas fluorescentes son un método popular para la visualización de las interacciones proteína-proteína en una célula viva, pero hasta ahora se han limitado a esta un función⁷. BiCAP representa un avance significativo en este sentido, esta técnica permite no sólo para visualización, pero también el aislamiento y el interrogatorio de la interacción proteína-proteína resultante.

Figura 1: la estructural principal detrás de la técnica del BiCAP. (A) un esquema que al Director detrás de muestra de complementación bimolecular de la fluorescencia las proteínas ‘bait’ y ‘presa’ con la etiqueta el N-terminal V1 o V2 C-terminal fragmentos de la proteína integral de Venus. (B) análisis estructural de la interfaz de interacción (cian) entre la GFP nanobody (verde) y Venus recombinada, mostrando la posición de la V1 (gris) y fragmentos de V2 (naranja) (PDB 3OGO de adhesión). Esta cifra es republicado fromCroucher et al.³ reimpreso con permiso de la AAAS. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

El BiCAP técnica hace uso de dos fragmentos no fluorescente de Venus (llamado V1 y V2) que asocian con un bajo grado de afinidad, a menos que una interacción se produce entre sus socios de fusión. En este caso, los dominios de dos split doblarle en la estructura funcional del β-barril del fluoróforo (figura 1B)⁶. La innovación clave del BiCAP proviene de la introducción de la recombinante GFP nanobody, que reconoce un epitopo tridimensional en el β-barril de GFP (y variantes como Venus) que sólo está presente en el fluoróforo correctamente recombinado y doblado ( Figura 1B)⁸. Crucial, la GFP nanobody no enlazar a cualquiera de los fragmentos individuales de Venus. Esto facilita el aislamiento de dímeros de proteínas sólo después de las dos proteínas forman un complejo de su propia voluntad, llevando a resultados más representativos que los adquirió de los métodos que hacen uso de interacciones químicamente inducida, forzada⁹.

BiCAP es una técnica poderosa que se centra específicamente en los complejos, que potencialmente pueden combinarse con un número de aplicaciones posteriores para mejorar el nivel de detalle de nuestra comprensión de estos complejos de papel en la transducción de señal . También incluye la característica importante de permitir la visualización de las interacciones de proteínas in situ. Hasta la fecha, BiCAP se ha demostrado como un método eficaz de analizar el interactoma de receptores tirosina quinasa (RTK) dímeros³, pero la capacidad de adaptación de este método significa que pueden adoptarse en casi cualquier contexto de interacción de proteínas.