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Disección señalización complejos por purificación de la afinidad de complementación Bimolecular (BiCAP)

Published: June 15, 2018
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Summary

Este manuscrito describe el protocolo para la purificación de afinidad de complementación Bimolecular (BiCAP). Este novedoso método facilita el aislamiento específico y la caracterización proteómica aguas abajo de cualquier dos proteínas obran recíprocamente, mientras que excluyendo un complejado proteínas individuales como complejos formados con competidores socios de enlace.

Abstract

El ensamblaje de complejos de proteínas es un mecanismo central subyacente a la regulación de muchas vías de señalización de la célula. Un enfoque principal de la investigación biomédica es descifrar cómo estos complejos proteína dinámica actúan para integrar señales de varias fuentes para dirigir una respuesta biológica específica, y cómo esto se convierte en liberalizado en muchos contextos de la enfermedad. A pesar de la importancia de este mecanismo bioquímico clave, hay una falta de técnicas experimentales que pueden facilitar la deconvolución específico y sensible de estos complejos multi moleculares de señalización.

Esta carencia se dirige aquí a través de la combinación de un ensayo de complementación de proteínas con un nanobody específicos de conformación, que hemos llamado purificación de afinidad de complementación Bimolecular (BiCAP). Esta nueva técnica facilita el aislamiento específico y la caracterización proteómica aguas abajo de cualquier par de interacción de proteínas, a la exclusión de un complejo proteínas individuales y complejos formados con competidores socios de enlace.

La técnica del BiCAP es adaptable a una amplia gama de ensayos experimentales aguas abajo, y el alto grado de especificidad de esta técnica permite más matizada las investigaciones sobre la mecánica del conjunto complejo de proteínas que es actualmente posible utilizar técnicas de purificación de afinidad estándar.

Introduction

Conjunto complejo de proteínas es un proceso clave en el mantenimiento de la especificidad espaciotemporal de muchos señalización vías1,2. Mientras que la naturaleza crítica de esta función reguladora es ampliamente reconocida, hay una falta de técnicas experimentales para estudiar estos complejos. La mayoría interactómica estudios se centran en las interacciones con las proteínas individuales, o el enriquecimiento secuencial de componentes complejos. Presentamos aquí una técnica para el aislamiento de un dímero de la proteína específica mientras que excluyendo las moléculas individuales de la componente de proteínas así como complejos formados con competencia vinculante socios3. Hemos llamado a esta técnica de purificación de afinidad de complementación Bimolecular (BiCAP), ya que es una combinación de un ensayo de complementación de fragmento de previamente existente proteína, complementación Bimolecular de la fluorescencia (centro), con el uso nuevo de un conformación específica nanobody recombinante GFP y sus derivados (ver tabla de materiales).

Un ensayo de complementación de fragmento de proteína típica se basa en la expresión de proteínas “presa” y el “cebo” fundido para dividir fragmentos de reporteros como luciferase4, β-galactosidasa5o proteína fluorescente verde (GFP)6 ( Figura 1A). A través de la interacción de las proteínas cebo y presa, los dominios de reportero de split se anima a doblar en una estructura funcional, que permiten la interacción del cebo y presa de proteínas para ser visualizado o cuantificado. BiCAP fue adaptado de una versión de esta técnica que hace uso de fragmentos de la variante de la GFP Venus. Ensayos de complementación de proteínas fluorescentes son un método popular para la visualización de las interacciones proteína-proteína en una célula viva, pero hasta ahora se han limitado a esta un función7. BiCAP representa un avance significativo en este sentido, esta técnica permite no sólo para visualización, pero también el aislamiento y el interrogatorio de la interacción proteína-proteína resultante.

Figure 1
Figura 1: la estructural principal detrás de la técnica del BiCAP. (A) un esquema que al Director detrás de muestra de complementación bimolecular de la fluorescencia las proteínas ‘bait’ y ‘presa’ con la etiqueta el N-terminal V1 o V2 C-terminal fragmentos de la proteína integral de Venus. (B) análisis estructural de la interfaz de interacción (cian) entre la GFP nanobody (verde) y Venus recombinada, mostrando la posición de la V1 (gris) y fragmentos de V2 (naranja) (PDB 3OGO de adhesión). Esta cifra es republicado fromCroucher et al.3 reimpreso con permiso de la AAAS. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

El BiCAP técnica hace uso de dos fragmentos no fluorescente de Venus (llamado V1 y V2) que asocian con un bajo grado de afinidad, a menos que una interacción se produce entre sus socios de fusión. En este caso, los dominios de dos split doblarle en la estructura funcional del β-barril del fluoróforo (figura 1B)6. La innovación clave del BiCAP proviene de la introducción de la recombinante GFP nanobody, que reconoce un epitopo tridimensional en el β-barril de GFP (y variantes como Venus) que sólo está presente en el fluoróforo correctamente recombinado y doblado ( Figura 1B)8. Crucial, la GFP nanobody no enlazar a cualquiera de los fragmentos individuales de Venus. Esto facilita el aislamiento de dímeros de proteínas sólo después de las dos proteínas forman un complejo de su propia voluntad, llevando a resultados más representativos que los adquirió de los métodos que hacen uso de interacciones químicamente inducida, forzada9.

BiCAP es una técnica poderosa que se centra específicamente en los complejos, que potencialmente pueden combinarse con un número de aplicaciones posteriores para mejorar el nivel de detalle de nuestra comprensión de estos complejos de papel en la transducción de señal . También incluye la característica importante de permitir la visualización de las interacciones de proteínas in situ. Hasta la fecha, BiCAP se ha demostrado como un método eficaz de analizar el interactoma de receptores tirosina quinasa (RTK) dímeros3, pero la capacidad de adaptación de este método significa que pueden adoptarse en casi cualquier contexto de interacción de proteínas.

Protocol

1. plásmido clonación Nota: Para generar vectores plásmidos con los tags V1 o V2 fusionados a la N-terminal o c-terminal del gen de interés, centro vectores de destino han sido depositadas con Addgene [etiqueta del N-terminal: pDEST-V1-ORF (#73635), pDEST-V2-ORF (#73636). Etiqueta C-terminal: pDEST-ORF-V1 (#73637), pDEST-ORF-V2 (#73638)]. Los gene/s de interés tendrá que ser en recombinación específica vectores de entrada compatibles (es decir, pDONR223 o pENTR221), la clonació…

Representative Results

Tras el uso de la clonación de recombinación para generar de V1 y V2 con la etiqueta de genes de interés con el centro pDEST plásmidos, la transfección de dos plásmidos que contienen un par de interacción de proteínas resultará en la generación de una señal fluorescente de Venus después de aproximadamente de 8 a 24 horas. En la ausencia de una señal positiva es posible que la interacción de la proteína no puede ocurrir debido a la opción de línea celular, una eficacia de …

Discussion

BiCAP es un método eficaz para aislar dímeros de la proteína específica mientras que excluyendo los componentes individuales y su competencia vinculante socios3. BiCAP se basa en la adaptación de un ensayo de complementación de proteínas de fluorescencia llamado Centro6. Los métodos existentes, incluyendo análisis de ligadura centro y proximidad, se han utilizado extensivamente para visualizar y cuantificar las interacciones de proteínas en células vivas<sup clas…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

D.R.C es un cáncer Instituto de NSW y D.N.S era previamente un cáncer Instituto de Nueva Gales del sur. Los resultados de la investigación presentados en este manuscrito fueron financiados por el cáncer Instituto de Nueva Gales del Sur (13/FRL/1-02 y 09/FCD/2-39), NHMRC (proyecto Grant GNT1052963), Fundación de Ciencias de España (11/GRIC/B2157), oficina de ciencia de Nueva Gales del sur e investigación médica de la familia de los Beca y Fundación de la familia Mostyn. J.F.H. y R.S. recibieron una concesión australiana del postgrado.

Materials

LR Clonase II Plus enzyme Thermo Fisher Scientific 12538120 Recombinase enzyme required for Gateway cloning (Step 1) into pDEST BiFC destination vectors
Proteinase K, recombinant, PCR grade Thermo Fisher Scientific EO0491
14 mL round-bottomed polypropylene tube Corning 352059
Ampicillin Roche Diagnostics Australia 10835242001 Stock solution prepared at 100 μg/mL in distilled water.
Miniprep kit Promega Corporation A1330
Maxiprep kit Life Technologies Australia K2100-07
DMEM Gibco 11995-073
FBS Life Technologies Australia 10099-141
Penicillin/Streptomycin Life Technologies Australia 15070-063
jetPRIME transfection buffer Polyplus 114-15
jetPRIME transfection reagent Polyplus 114-15
PhosSTOP (Phosphatase inhibitor) Sigma-Aldrich 4906837001
cOmplete, Mini, EDTA-free Protease inhibitor cocktail Roche 11873580001
Cell Scraper Sarstedt 83.1832
GFP-Trap_A Chromotek Gmbh gta-100 GFP nanobody coupled to agarose beads
N-terminal GFP monoclonal antibody  Covance MMS-118P Will detect the V1 tag within the BiFC vectors
C-terminal GFP monoclonal antibody Roche 11814460001 Will detect the V2 tag within the BiFC vectors
Sample buffer Invitrogen NP0008 Supplemented with 1 mL β-mercaptoethanol.
Sequencing grade modified trypsin Promega Corporation V5117h
LoBind microcentrifuge tubes Point of Care Diagnostics 0030 108 116
Iodoacetamide Sigma-Aldrich I1149-5G Prepared at 5 mg/mL in ultrapure water
Trifluoroacetic Acid – Sequanal Grade Thermo Fisher 10628494
3M Empore solid phase extraction C18 disks (octadecyl) – 4.7 cm Thermo Fisher 14-386-2 To prepare stage tips, cut 1 mm disks using an appropriately sized hole punch. Alternatively, pre-prepared stage tips can also be purchased, see below.
C18 Stage Tips, 10 µL bed Thermo Fisher 87782
Formic acid OPTIMA for LC/MS grade 50mL Thermo Fisher FSBA117-50
1.9 μm C18 ReproSil particles Dr. Maisch GmbH r119.aq. Stationary phase particles
Acetonitrile OPTIMA LC/MS grade  Thermo Fisher FSBA955-4
Easy-nLC HPLC  Thermo Fisher
LTQ Orbitrap Velos Pro Thermo Fisher
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787 Non-ionic detergent (100%)
DH5α cells Thermo Fisher Heat-shock-competent cells

References

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Hastings, J. F., Han, J. Z., Shearer, R. F., Kennedy, S. P., Iconomou, M., Saunders, D. N., Croucher, D. R. Dissecting Multi-protein Signaling Complexes by Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP). J. Vis. Exp. (136), e57109, doi:10.3791/57109 (2018).

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