Dissection multi-signalisation Complexes protéiques par Purification d’affinité de complémentation bimoléculaire (BiCAP)

Assemblage complexe de protéine est un processus clé dans le maintien de la spécificité spatio-temporelle de nombreuses signalisation des voies^1,2. Bien que la nature essentielle de ce rôle réglementaire est largement reconnue, il y a un manque de techniques expérimentales disponibles à scruter ces complexes. La plupart des études interactomique mettre l’accent sur les interactions avec les protéines individuelles, ou l’enrichissement séquentiel des composants complexes. Nous présentons ici une technique pour l’isolation d’un dimère de protéine spécifique tout en excluant les portions individuelles de la protéines composant, mais aussi les complexes formés avec liant les partenaires³en compétition. Nous avons appelé cette technique bimoléculaire Purification d’affinité de complémentation (BiCAP), telle qu’elle est une combinaison d’un dosage de complémentation de fragment protéique déjà existantes, bimoléculaire complémentation de Fluorescence (BiFC), avec la nouvelle utilisation d’un conformation spécifique nanobody recombinante vers GFP et de ses dérivés (voir Table des matières).

Une analyse de complémentation de fragment de protéine typique se fonde sur l’expression des protéines « appât » et « proie » fusionnés pour fractionner des fragments de reporters comme luciférase,⁴,⁵de la β-galactosidase ou protéine fluorescente verte (GFP)⁶ ( Figure 1 a). Par le biais de l’interaction des protéines appât et proies, les domaines de journaliste de split sont encouragés à replier dans une structure fonctionnelle, qui permet l’interaction de l’appât et de protéines pour être visualisées ou quantifié la proie. BiCAP a été adapté d’une version de cette technique qui fait utiliser des fragments de la variante GFP Venus. Protéine fluorescente complémentation dosages sont une méthode populaire pour la visualisation des interactions protéines-protéines dans une cellule en direct, mais jusqu’à présent ont été limitées à cette un fonction⁷. BiCAP représente une avancée significative à cet égard, car cette technique permet non seulement pour la visualisation, mais aussi l’isolement et l’interrogatoire de l’interaction protéine-protéine qui en résulte.

Figure 1 : le capital structurel derrière la technique BiCAP. (A) un schéma décrivant l’entité de sécurité derrière l’affichage de complémentation de fluorescence bimoléculaire les protéines « appât » et « proie » marquées par le N-terminal V1 ou V2 C-terminal des fragments de la protéine pleine longueur de Vénus. (B) analyse structurale de l’interface d’interaction (cyan) entre la GFP nanobody (vert) et Vénus recombinée, montrant la position de la V1 (gris) et des fragments de V2 (orange) (APB adhésion 3OGO). Ce chiffre est republié fromCroucher Al³ reproduit avec la permission de l’AAAS. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Le BiCAP technique fait usage de deux fragments non fluorescent de Vénus (nommé V1 et V2), qui associent avec un faible degré d’affinité, à moins qu’une interaction se produit entre leurs partenaires en matière de fusion. Dans ce cas, les domaines deux split replier dans la structure fonctionnelle de la β-baril du fluorophore (Figure 1 b)⁶. L’innovation majeure de BiCAP provient de l’introduction de la recombinaison nanobody GFP, qui reconnaît un épitope en trois dimensions sur le β-Canon de GFP (et des variantes telles que Vénus) qui n’est présent que sur le fluorophore recombiné et correctement plié ( Figure 1 b)⁸. Fondamentalement, la GFP nanobody ne lie pas à un des fragments individuels Venus. Ceci facilite l’isolement des dimères de protéine qu’après que les deux protéines ont formé un complexe de leur propre gré, conduisant à des résultats plus représentatives que celles acquises des méthodes qui rendent l’utilisation de chimiquement induite, forcé les interactions⁹.

BiCAP est une technique puissante qui se concentre spécifiquement sur les complexes de protéines multiples, qui peuvent potentiellement être combinées avec un certain nombre d’applications en aval afin d’améliorer la granularité de notre compréhension du rôle à jouer ces complexes dans la transduction du signal . Elle englobe également la caractéristique importante de ce qui permet la visualisation des interactions de protéine in situ. A ce jour, BiCAP a été démontrée comme une méthode efficace d’analyse de l’interactome des récepteurs tyrosine kinase (RTK) dimères³, mais la capacité d’adaptation de cette méthode signifie qu’il pourra être adopté dans presque n’importe quel contexte d’interaction de protéine.