Kornea Greftlerinde Stromal Özelliklerin Histoloji Benzeri Analizi için Tam Alan Optik Koherens Mikroskopisi
Summary
Tam alan optik koherens mikroskopisinin kornea donör stromasının yüksek kalitede değerlendirilmesi için bir yöntem olarak kullanımını tanımladık. Bu protokol, sağlık veya hastalığın göstergesi olan özellikleri tanımlamak için kullanılabilir ve donör dokuların taranmasını ve seçimini ve dolayısıyla keratoplasti sonuçlarını iyileştirmeyi amaçlar.
Abstract
Toplam kornea kalınlığının yaklaşık% 90’ını oluşturan donör kornea stromasının kalitesinin, derin anterior lameller ve penetran keratoplastinin başarısı için majör olmasa da ana sınırlayıcı faktörlerden biri olması muhtemeldir. Bunlar, hastalıklı kornea tabakalarının bir kısmının veya tamamının, sırasıyla, yakın zamanda ölen bir kişiden alınan bağışlanan doku, greft ile değiştirilmesini içeren cerrahi prosedürlerdir. Bununla birlikte, göz bankalarında kornea greftlerinin stromal kalitesini değerlendirme araçları sınırlıdır ve hastalık göstergelerinin yüksek çözünürlüklü kantitatif değerlendirme yeteneğinden yoksundur. Taze veya sabit ex vivo biyolojik doku örneklerinin yüksek çözünürlüklü 3D görüntülenmesine izin veren tam alan optik koherens mikroskopisi (FF-OCM), donör kornea değerlendirmesi için çok uygun non-invaziv bir tekniktir. Burada FF-OCM kullanılarak kornea stromasının kalitatif ve kantitatif analizi için bir yöntem tanımlanmıştır. Protokol normal donör kornealara ve patolojik kornea düğmelerine başarıyla uygulanmıştır ve hem makroskobik hem de mikroskobik düzeyde sağlıklı ve patolojik özellikleri tanımlamak için kullanılabilir, böylece keratoplasti sonucunu tehlikeye atabilecek stromal bozuklukların tespitini kolaylaştırır. Greft kalite kontrolünü geliştirerek, bu protokol donör dokuların daha iyi seçilmesine (ve reddedilmesine) ve dolayısıyla greft başarısızlığının azalmasına neden olma potansiyeline sahiptir.
Introduction
Kornea hastalıkları tüm dünyada körlüğün başlıca nedenleri arasındadır1. Bazı hastalıklar sadece cerrahi olarak tedavi edilebilir, genellikle yakın zamanda ölen bir kişiden alınan bağışlanmış doku, greft ile kısmen (yani lameller keratoplasti) veya tüm (yani penetran keratoplasti) hastalıklı korneanın değiştirilmesini içerir. Endoteli etkilemeyen kornea hastalıkları için (örneğin, keratokonus, enfeksiyöz keratit sonrası stromal skarlar, travma ve stromal distrofiler), derin anterior lameller keratoplasti (DALK) şu anda tercih edilen cerrahi teknik olarak kabul edilmektedir 2,3,4,5. Bu teknik, daha düşük greft reddi insidansı, endotel reddi yokluğu, daha düşük endotel hücre kaybı ve uygun maliyet-etkinlik oranı 6,7,8,9,10,11 ile ilişkili olan sadece merkezi kornea epiteli ve stromanın yerini alarak alıcının kornea endotelinin korunmasını mümkün kılar . DALK ayrıca, optimal endotel kalitesinden daha düşük olan korneaların greft olarak kullanılmasına izin verir, çünkü bu tehlikeye giren tabaka nakledilmeyecektir12. Tersine, donör kornea stromasının kalitesinin greft başarısı ve görme iyileşmesi için ana sınırlayıcı faktör olması muhtemeldir, çünkü stroma kalan tek donör kornea tabakasıdır, donör epitel ise alıcı epitel ile değiştirilecektir. Ne yazık ki, göz bankalarında donör kornea stromasını değerlendirme olanakları sınırlıdır. Genellikle enükleasyon ile doku alımı yapıldığında donör göz küresinin yarık lamba muayenesini ve donör stroma13’ün ışık mikroskobu muayenesini içerir. Bazı göz bankaları, Fourier etki alanı optik koherens tomografisi (FD-OCT)14 kullanarak bu tür standart prosedürleri desteklemeye başlamıştır.
Ultrason görüntüleme15’e optik bir analog olan oftalmik optik koherens tomografi (OCT), retina 16 ve ön segment17’nin optik kesitlerini oluşturmak için geniş bant veya ayarlanabilir ışığın parazitini kullanır. Erken klinik sistemlerin temeli olan zaman alanı OCT’de, bir referans aynasının konumu değiştirilir, böylece referans ışını çeşitli doku arayüzlerinde yansıyan ışınla neredeyse aynı miktarda zaman geçirdiğinde, A-taramaları zamanın bir fonksiyonu olarak üretilir. Çoğu modern klinik sistemin temeli olan FD-OCT’de (spektral veya frekans alanı OCT olarak da adlandırılır), referans aynası bir konuma sabitlenir ve tüm girişim kalıpları birbirine karıştırılmış bireysel bir A-taraması bir seferde elde edilir ve Fourier analizi ile parçalara ayrılır.
Klinik (zaman veya spektral alan) OKT sistemleri, korneanın kesitsel görünümlerine ve yarık lambalı biyomikroskopiden daha yüksek bir eksenel çözünürlükte stromal opasitelerin saptanmasına izin verirken, yanal çözünürlükleri sınırlıdır. Konfokal mikroskopi18 , korneanın histolojik detaylara yaklaşan lateral bir çözünürlükte incelenmesine izin verir, ancak aksiyel olarak sınırlıdır.
Tam alan optik koherens tomografik mikroskopi (FF-OCT veya FF-OCM)19,20, hem konfokal mikroskopi hem de OCT elemanlarını birleştirerek, yaklaşık 1 μm’lik eksenel çözünürlükle karşılaştırılabilir bir yanal çözünürlük elde eder. Daha spesifik olarak, FF-OCM, yanal tarama olmadan yüz 2D tomografik görüntüler elde etmek için tutarsız geniş bant ışık kaynakları (örneğin, bir halojen lamba) ve yüksek sayısal diyaframlı optikler kullanır. FF-OCM, derinlik yönünde tarama yaparak, taze veya sabit ex vivo biyolojik doku örneklerinin non-invaziv 3D görüntülenmesini sağlar. Korneayı görüntülemek için kullanılmıştır21,22,23. FF-OCM, hem yüksek çözünürlüklü en yüz hem de kesitsel görünümler sağlayarak, korneanın hem histolojik yapısı hem de hücresel detayları hakkında bilgi sağlar. Aslında, FF-OCM’nin histolojiden daha üstün yapısal bilgi sağladığı gösterilmiştir ve spektral-domain OCT ve konfokal mikroskopi24,25 kombinasyonu ile mümkün olduğunca daha fazla hastalık göstergesini tanımlayabilmiştir.
Burada FF-OCM kullanılarak kornea donör stromasının kalitatif ve kantitatif değerlendirilmesi için bir protokol tanımlanmıştır. Yöntem, üç kantitatif stromal parametre (yani, Bowman’ın tabaka kalınlığı ve değişkenliği ve stromal yansıtıcılığı) dahil olmak üzere, stromal durumun göstergesi olan makroskopik ve mikroskobik özelliklerin histoloji benzeri analizine dayanmaktadır. Bu nedenle tarif edilen protokol normal ve anormal kornea dokularına uygulanır ve hastalıklı kişilerin normal insan kornea dokularından ayırt edilmesine izin verir.
Protocol
Representative Results
Discussion
FF-OCM kullanılarak kornea donör stromasının kalitatif ve kantitatif değerlendirmesi için burada açıklanan protokol, spektral etki alanı OKT ve konfokal mikroskopi21,24,25’in yeteneklerinin ötesinde, stromal durumun göstergesi olan makroskopik ve mikroskobik özelliklerin histoloji benzeri analizine dayanmaktadır ve hastalıklıların normal insan dokularından ayırt edilmesini sağlar.
İnsan donör kornealarının speküler mikroskopi ile mükemmel bir endotel kalitesi değerlendirmesinin yanı sıra, stromal kalitenin değerlendirilmesi göz bankalarında zordur ve genellikle mevcut protokollerde yarık lamba biyomikroskobu ve / veya ışık mikroskobu ile brüt bir gözlemle sınırlıdır. Mevcut yöntemlerle iyi rezolüsyon eksikliği, sadece keratoplasti sonucunu tehlikeye atan bazı stromal hastalığı olan korneaların seçilebileceği anlamına gelmez, aynı zamanda korneaların aslında anterior stroma veya epitel bölgelerine kısıtlayıcı olan stromal opasiteler için reddedilebileceği ve endotelyal keratoplasti prosedürleri için hala kullanılabileceği anlamına gelir14.
Mevcut göz bankası protokolü, üstün çözünürlüğü nedeniyle, korneanın, özellikle de stromanın (Bowman tabakası dahil) kalite değerlendirmesini tamamlamak için güçlü ve invaziv olmayan bir araç oluşturan FF-OCM’nin eklenmesiyle desteklenebilir. Yarık lamba incelemesinden farklı olarak, greft, FF-OCM görüntü alımı boyunca depolama ortamıyla dolu kapalı bir odaya daldırılmış halde kalır ve olası kontaminasyon riskini azaltır.
FF-OCM ile başarılı görüntü elde etmek için (bakınız Malzeme Tablosu), mikroskop hedefinin numune tutucunun kapak kaymasının üzerine uygulanan optik jele iyice daldırılması önemlidir (adım 2.2.3). Ayrıca, başarısız otomatik ayarlamadan sonra da gerçekleştirilecek bir prosedür olan cihazın kalibrasyonunun düzenli olarak kontrol edilmesi önerilir (adım 2.2.2) ve edinme yazılımındaki “Araçlar ve seçenekler” aracılığıyla erişilir (bkz. Numune tutucuda bir kalibrasyon aynasının kullanılmasını içeren prosedür, normal numune hazırlama ile aynıdır (bkz. adım 1.2), ancak optik jel, kapak kaymasının konumlandırılmasından önce aynaya uygulanmalıdır.
Mevcut göz bankası prosedürlerine göre normal stromaya sahip olduğu düşünülen bir dizi donör kornea grefti bu yazıdaki protokolü tanımlamak ve özellikle donör stromal kalitesinin kesin ve güvenilir bir şekilde değerlendirilmesi için FF-OCM’nin uygunluğunu göstermek için kullanılmıştır. Bu normal donör kornealar, depolama ortamına daldırılmış patolojik kornealarla karşılaştırıldı ve kornea greftlerinde çeşitli stromal özelliklerin (Şekil 2, Şekil 3, Şekil 4, Şekil 5, Şekil 6, Şekil 7 ve Şekil 8’de gösterilmiştir) FF-OCM ile mümkün kılınan histoloji benzeri analizin, hastalıklı insan kornea dokularını normal insan kornea dokularından ayırt etmeyi sağladığını göstermiştir.
Skar varlığı (Şekil 5 ve Şekil 7), fibrotik doku (Şekil 8), göller (Şekil 2), Vogt striae (Şekil 4) veya artmış stromal sinir çapı (Şekil 4) gibi morfolojik değişikliklerin yanı sıra, hastalıklı kornealarda tipik stromal özellikler mevcuttur. Stromal kalite değerlendirmesinde özellikle ilgili olan stromal parametreler, Bowman’ın tabaka kalınlığı ve değişkenliği ve stromal yansıtıcılığı gibi görünmektedir. Protokol içindeki kritik adımlar bu nedenle 4.1 ve 4.3 adımlarıdır.
İnsan kornea gelişimi sırasında salgılanırken, özellikle Bowman’ın tabakası 19 haftalık gebelik ile belirginleşir ve doğumdan sonra asla onarılmaz32. Bowman tabakasına verilen hasar bu nedenle geri dönüşümsüzdür ve refraktif cerrahi, enfeksiyöz keratit, keratokonusun neden olduğu hasar da dahil olmak üzere donör kornea dokusundaki önceki stromal hasarın ideal bir göstergesi olarak hizmet eder. Donör kornea kullanımı için kontrendikasyonları oluşturan bu tür kornea hastalıkları, kesilme ve skarlaşma nedeniyle azalmış ve değişken Bowman tabaka kalınlığı ile ilişkilidir (Şekil 5) ve donör öyküsü tam olarak bilinmediğinde mevcut göz bankası protokolleri tarafından gözden kaçırılması muhtemeldir.
Postmortem kornea ödemi nedeniyle donör ölümünden sonra kornea saydamlığı bozulsa da, geri saçılan ışık miktarının veya stromal yansıtıcılığın stromadaki derinlikle katlanarak azalması beklenmektedir (bkz. Şekil 3 ve Şekil 4A); Sonuç olarak, normalize stromal yansıtıcılığın logaritması, normal donör kornealarda stromal derinliğin doğrusal bir fonksiyonu olacaktır ve 1’e yakın R-kare değerleriyle temsil edilecektir. Tersine, makroskopik özelliklerin varlığı doğrusal olmayan logaritmik derinlik profilleri ile ilişkilidir ve stromal hastalığın göstergesidir (Şekil 4B ve Şekil 7)25.
Keratosit yoğunluğu stromal kollajen fibril ve hücre dışı matriks sentezi ve yenilenmesinden sorumlu olduğundan, keratosit yoğunluğunun donör stromal kalitesini değerlendirmek için başka bir ilgili parametre olduğunu ve çok düşük keratosit sayısı gösteren dokuların nakledilmemesi gerektiğini varsaymak makul görünmektedir. Bu nedenle protokol, göz bankalarında kolayca kullanılabilen FF-OCM görüntülerinden keratosit yoğunluğunu ölçmek için hassas ve güvenilir bir yöntem içerir25 ve konfokal mikroskopi kuralını izler. FF-OCM ile, keratosit yoğunluğunun, keratositlerin doğrudan kesitsel görünüm33’te sayılmasıyla da belirlenebileceğini unutmayın; bu, keratositlerin birden fazla yüz diliminde sayılmasını gerektiren konfokal mikroskopiye göre potansiyel bir avantajdır. Bununla birlikte, keratosit yoğunluklarının hastalık hastalarında normal kontrollerden 34,35,36,37 daha düşük olduğu ve hastalık şiddeti34,38 ile ilişkili olduğu gösterilen canlı hastalardan farklı olarak, insan ex vivo doku örneklerinde durum böyle değildi 25 ve transplantasyon sonrası iyi görsel iyileşme ile sonuçlanması için donör kornealarda minimum sayıda keratosit gerekip gerekmediğini belirlemek için daha ileri çalışmalara ihtiyaç vardır. Patolojik dokuda olduğu gibi donör dokuda da düşük keratosit yoğunluğu yaşlanma, iskeminin neden olduğu hücrelerin postmortem kaybı ve/veya donör dokunun depolanması ile açıklanabilir 27,39,40,41. Ayrıca belirtmek gerekir ki, bu protokolde elde edilen ve görüntülenen normal donör korneaların AB Göz Bankası Birliği standartlarına göre endotel kalitesinin düşük olması nedeniyle nakil öncesi ya depolanmış ve ödemli ya da şişmiş ya da göz bankası tarafından atılmış olduğu da belirtilmelidir. FF-OCM görüntüleme, tarif edilen protokolle birlikte göz bankası ortamına dahil edilecek olsaydı, kornealar tipik olarak keratosit yoğunluklarını etkileyebilecek olandan daha taze bir durumda değerlendirilirdi.
Stromal kalite analizi için burada açıklanan protokol, kalınlık ve yapı21,24 açısından FF-OCM ile de çözülebilen Descemet membranının değerlendirilmesi için genişletilebilir. Bu, ince Descemet’in membranlarının stromadan ayrılmasının daha zor olabileceği Descemet’in membran endotelyal keratoplastisi için doku seçiminde yararlı olabilir.
Sonuç olarak, FF-OCM, depolama sırasında insan donör kornea stromasının hassas ve güvenilir bir şekilde değerlendirilmesini sağlar. Greft kalitesini artırarak, bu protokolün mevcut göz bankacılığı prosedürlerine eklenmesi, donör dokuların taranmasını ve seçimini ve dolayısıyla keratoplasti sonuçlarını iyileştirme potansiyeline sahiptir. FF-OCM cihazının göz bankası rutinine gerçek hayattaki entegrasyonu, özel bir CMOS kameranın geliştirilmesi sayesinde daha hızlı görüntü elde etme ve daha geniş görüş alanı ve görüntüleme sırasında kornea depolama ve kullanım için özel steril tek kullanımlık kasetlerin tasarımı da dahil olmak üzere son teknolojik güncellemelerle kolaylaştırılmalıdır.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Agence Nationale de Recherche’den (ANR), PRTS (Projet de Recherche Translationelle en Santé) hibe No ANR-13-PRTS-0009 (V.B.) kapsamında ve Marie Skłodowska-Curie hibe anlaşması No 709104 (K.I.) kapsamında Avrupa Birliği’nin Horizon 2020 araştırma ve inovasyon programından fon almıştır. Yazarlar, hücre sayımı ve histolojik işleme konusundaki yardımları için Céline de Sousa’ya teşekkür eder.
Materials
| Light-CT Scanner | LLTech, France | http://www.lltechimaging.com/products-applications/products/ | FF-OCM device used in this manuscript for imaging |
| CorneaJet | EuroBio, France | http://www.eurobio-cornea.com/en/corneamax-10-100-ml-xml-352-822.html | Organ culture medium in which donor corneas are stored |
| CorneaMax | EuroBio, France | http://www.eurobio-cornea.com/en/corneajet-10-50-ml-xml-352-823.html | Dextran-supplemented organ culture medium used for deturgescence |
| Fiji (ImageJ) | National Institute of Health, Bethesda, MD, USA | https://fiji.sc/ | Open source image processing software |
| Matlab | Mathworks, Inc., Natick, MA, USA | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | Mathematical computing software |
References
- Pascolini, D., Mariotti, S. P. Global estimates of visual impairment. Br J Ophthalmol. 96, 614-618 (2010).
- Shimazaki, J., Shimmura, S., Ishioka, M., Tsubota, K. Randomized clinical trial of deep lamellar keratoplasty vs penetrating keratoplasty. Am J Ophthalmol. 134, 159-165 (2002).
- Tsubota, K., Kaido, M., Monden, Y., Satake, Y., Bissen-Miyajima, H., Shimazaki, J. A new surgical technique for deep lamellar keratoplasty with single running suture adjustment. Am J Ophthalmol. 126, 1-8 (1998).
- Busin, M., Zambianchi, L., Arffa, R. C. Microkeratome-assisted lamellar keratoplasty for the surgical treatment of keratoconus. Ophthalmology. 112, 987-997 (2005).
- Amayem, A. F., Anwar, M. Fluid lamellar keratoplasty in keratoconus. Ophthalmology. 107, 76-79 (2000).
- Borderie, V. M., Guilbert, E., Touzeau, O., Laroche, L. Graft rejection and graft failure after anterior lamellar versus penetrating keratoplasty. Am J Ophthalmol. 151, 1024-1029 (2011).
- Borderie, V. M., Sandali, O., Bullet, J., Gaujoux, T., Touzeau, O., Laroche, L. Long-term results of deep anterior lamellar versus penetrating keratoplasty. Ophthalmology. 119, 249-255 (2012).
- Koo, T. S., Finkelstein, E., Tan, D., Mehta, J. S. Incremental cost-utility analysis of deep anterior lamellar keratoplasty compared with penetrating keratoplasty for the treatment of keratoconus. Am J Ophthalmol. 152, 40-47 (2011).
- Bahar, I., Kaiserman, I., Srinivasan, S., Ya-Ping, J., Slomovic, A. R., Rootman, D. S. Comparison of three different techniques of corneal transplantation for keratoconus. Am J Ophthalmol. 146, 905-912 (2008).
- Bahar, I., Kaiserman, I., Srinivasan, S., Ya-Ping, J., Slomovic, A. R., Rootman, D. S. Longterm results of deep anterior lamellar keratoplasty for the treatment of keratoconus. Am J Ophthalmol. 151, 760-767 (2011).
- Cheng, Y. Y., et al. Endothelial cell loss and visual outcome of deep anterior lamellar keratoplasty versus penetrating keratoplasty: a randomized multicenter clinical trial. Ophthalmology. 118, 302-309 (2011).
- Borderie, V. M., Sandali, O., Bullet, J., Guilbert, E., Goldschmidt, P., Laroche, L. Donor tissue selection for anterior lamellar keratoplasty. Cornea. 32, 1105-1109 (2013).
- Borderie, V., Martinache, C., Sabolic, V., Touzeau, O., Laroche, L. Light microscopic evaluation of human donor corneal stroma during organ culture. Acta Ophthalmol Scand. 76, 154-157 (1998).
- Bald, M. R., Stoeger, C., Galloway, J., Tang, M., Holiman, J., Huang, D. Use of fourier-domain optical coherence tomography to evaluate anterior stromal opacities in donor corneas. J Ophthalmol. 2013. 397680, (2013).
- Huang, D., et al. Optical coherence tomography. Science. 254, 1178-1181 (1991).
- Swanson, E. A., et al. In vivo retinal imaging by optical coherence tomography. Opt Lett. 18, 1864-1866 (1993).
- Izatt, J. A., et al. Micrometer-scale resolution imaging of the anterior eye in vivo with optical coherence tomography. Arch Ophthalmol. 112, 1584-1589 (1994).
- Stave, J., Zinser, G., Grummer, G., Guthoff, R. Modified Heidelberg retinal tomograph HRT. Initial results of in vivo presentation of corneal structures. Ophthalmologe. 99, 276-280 (2002).
- Beaurepaire, E., Boccara, A. C., Lebec, M., Blanchot, L., Saint-Jalmes, H. Full-field optical coherence microscopy. Opt Lett. 23, 244-246 (1998).
- Dubois, A., Vabre, L., Boccara, A. C., Beaurepaire, E. High-resolution full-field optical coherence tomography with a Linnik microscope. Appl Opt. 41, 805-812 (2002).
- Ghouali, W., et al. Full-field optical coherence tomography of human donor and pathological corneas. Curr Eye Res. 24, 1-9 (2014).
- Akiba, M., et al. Ultrahigh-resolution imaging of human donor cornea using full-field optical coherence tomography. J Biomed Opt. 12, 041202 (2007).
- Latour, G., Georges, G., Lamoine, L. S., Deumie, C., Conrath, J., Hoffart, L. Human graft cornea and laser incisions imaging with micrometer scale resolution full-field optical coherence tomography. J Biomed Opt. 15, 056006 (2010).
- Grieve, K., Georgeon, C., Andreiuolo, F., Borderie, M., Ghoubay, D., Rault, J., Borderie, V. M. Imaging microscopic features of keratoconic corneal morphology. Cornea. 35, 1621-1630 (2016).
- Borderie, M., et al. New parameters in assessment of human donor corneal stroma. Acta Ophthalmol. 95. 297, e297-e306 (2017).
- Borderie, V. M., Scheer, S., Touzeau, O., Vedie, F., Carvajal-Gonzalez, S., Laroche, L. Donor organ cultured corneal tissue selection before penetrating keratoplasty. Br J Ophthalmol. 82, 382-388 (1998).
- Borderie, V. M., Baudrimont, M., Lopez, M., Carvajal, S., Laroche, L. Evaluation of the deswelling period in dextran-containing medium after corneal organ culture. Cornea. 16, 215-223 (1997).
- Tech, L. L. . , (2017).
- Doughty, M. J., Müller, A., Zaman, M. L. Assessment of the reliability of human corneal endothelial cell-density estimates using a noncontact specular microscope. Cornea. 19, 148-158 (2000).
- Irsch, K., Borderie, M., Grieve, K., Plamann, K., Laroche, L., Borderie, V. M. Objective analysis of stromal light backscattering with full-field optical coherence tomographic microscopy shows potential to quantify corneal transparency. Frontiers in Optics. OSA Technical Digest (online), paper FW6A.6. , (2015).
- Bocheux, R., Pernot, P., Borderie, V., Plamann, K., Irsch, K. Quantitative measures of corneal transparency, derived from objective analysis of depth-resolved corneal images, demonstrated with full-field optical coherence tomographic microscopy. PLoS ONE. e0221707. 14, (2019).
- Karimi, A. H., Wong, A., Bizheva, K. Automated detection and cell density assessment of keratocytes in the human corneal stroma from ultrahigh resolution optical coherence tomograms. Biomed Opt Express. 2, 2905-2916 (2011).
- Ku, J. Y., Niederer, R. L., Patel, D. V., Sherwin, T., McGhee, C. N. Laser scanning in vivo confocal analysis of keratocyte density in keratoconus. Ophthalmology. 115, 845-850 (2008).
- Ozgurhan, E. B., Kara, N., Yildirim, A., Bozkurt, E., Uslu, H., Demirok, A. Evaluation of corneal microstructure in keratoconus: a confocal microscopy study. Am J Ophthalmol. 156, 885-893 (2013).
- Erie, J. C., Patel, S. V., McLaren, J. W., Nau, C. B., Hodge, D. O., Bourne, W. M. Keratocyte density in keratoconus. A confocal microscopy study. Am J Ophthalmol. 134, 689-695 (2002).
- Imre, L., Resch, M., Nagymihaly, A. Konfokale In-vivo-Hornhautmikroskopie nach Keratoplastik. Ophthalmology. 102, 140-146 (2005).
- Niederer, R. L., Perumal, D., Sherwin, T., McGhee, C. N. Laser scanning in vivo confocal microscopy reveals reduced innervation and reduction in cell density in all layers of the keratoconic cornea. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49, 2964-2970 (2008).
- Patel, S., McLaren, J., Hodge, D., Bourne, W. Normal human keratocyte density and corneal thickness measurement by using confocal microscopy in vivo. Invest Ophthalmol Vis Sci. 42, 333-339 (2001).
- Komuro, A., Hodge, D. O., Gores, G. J., Bourne, W. M. Cell death during corneal storage at 4 degrees. C. Invest Ophthalmol Vis Sci. 40, 2827-2832 (1999).
- Gambato, C., Longhin, E., Catania, A. G., Lazzarini, D., Parrozzani, R., Midena, E. Aging and corneal layers: an in vivo corneal confocal microscopy study. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 253, 267-275 (2015).
