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Immunology and Infection

Microscopie à cohérence optique plein champ pour l’analyse histologique des caractéristiques stromales dans les greffes de cornée

Published: October 21, 2022
doi:
10.3791/57104
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1Vision Institute,Sorbonne University, UM 80 / INSERM, UMR_S 968 / CNRS, UMR_7210, 2Quinze Vingts National Ophthalmology Hospital, 3Laboratory of Ophthalmic Instrument Development, The Wilmer Eye Institute,Johns Hopkins University School of Medicine, 4Laboratory for Optics and Biosciences (LOB),École polytechnique, 5LOA – ENSTA Paris,École polytechnique

Summary

Nous décrivons l’utilisation de la microscopie par cohérence optique plein champ comme méthode d’évaluation de haute qualité du stroma cornéen du donneur. Ce protocole peut être utilisé pour identifier les caractéristiques indicatives de la santé ou de la maladie, et vise à améliorer le dépistage et la sélection des tissus du donneur, et donc les résultats de la kératoplastie.

Abstract

La qualité du stroma cornéen du donneur, qui représente environ 90% de l’épaisseur cornéenne totale, est susceptible d’être l’un des principaux, sinon le principal, facteur limitant le succès de la kératoplastie lamellaire antérieure profonde et pénétrante. Il s’agit d’interventions chirurgicales qui consistent à remplacer une partie ou la totalité des couches cornéennes malades, respectivement, par un don de tissu, le greffon, prélevé sur une personne récemment décédée. Cependant, les moyens d’évaluer la qualité stromale des greffes de cornée dans les banques oculaires sont limités et ne permettent pas d’évaluer quantitativement à haute résolution les indicateurs de maladie. La microscopie par cohérence optique plein champ (FF-OCM), qui permet l’imagerie 3D haute résolution d’échantillons de tissus biologiques ex vivo frais ou fixes, est une technique non invasive bien adaptée à l’évaluation de la cornée du donneur. Nous décrivons ici une méthode d’analyse qualitative et quantitative du stroma cornéen à l’aide de FF-OCM. Le protocole a été appliqué avec succès aux cornées normales des donneurs et aux boutons cornéens pathologiques, et peut être utilisé pour identifier les caractéristiques saines et pathologiques au niveau macroscopique et microscopique, facilitant ainsi la détection des troubles stromaux qui pourraient compromettre le résultat de la kératoplastie. En améliorant le contrôle de la qualité du greffon, ce protocole a le potentiel d’entraîner une meilleure sélection (et rejet) des tissus du donneur et donc une diminution de l’échec du greffon.

Introduction

Les maladies cornéennes sont parmi les principales causes de cécité dans le monde1. Certaines maladies ne peuvent être traitées que chirurgicalement, impliquant souvent le remplacement d’une partie (c.-à-d. kératoplastie lamellaire) ou de la totalité (kératoplastie pénétrante) de la cornée malade, par un don de tissu, le greffon, prélevé sur une personne récemment décédée. Pour les maladies cornéennes qui n’affectent pas l’endothélium (par exemple, kératocône, cicatrices stromales après kératite infectieuse, traumatisme et dystrophies stromales), la kératoplastie lamellaire antérieure profonde (DALK) est actuellement considérée comme la technique chirurgicale de choix 2,3,4,5. Cette technique permet de préserver l’endothélium cornéen de la receveuse, en remplaçant uniquement l’épithélium cornéen central et le stroma, ce qui est associé à une incidence plus faible de rejet de greffe, à l’absence de rejet endothélial, à une perte de cellules endothéliales plus faible et à un rapport coût-efficacité favorable 6,7,8,9,10,11 . DALK permet en outre d’utiliser des cornées dont la qualité de l’endothélium est moins qu’optimale comme greffes, car cette couche compromise ne sera pas transplantée12. Inversement, la qualité du stroma cornéen du donneur est susceptible d’être le principal facteur limitant le succès du greffon et la récupération de la vision, car le stroma est la seule couche cornéenne du donneur à rester, tandis que l’épithélium du donneur sera remplacé par l’épithélium receveur. Malheureusement, les moyens d’évaluer le stroma cornéen du donneur dans les banques oculaires sont limités. Ils comprennent généralement un examen à la lampe à fente du globe oculaire du donneur lorsque le prélèvement tissulaire est effectué par énucléation et un examen au microscope optique du stromadonneur 13. Certaines banques d’yeux ont commencé à compléter ces procédures standard en utilisant la tomographie par cohérence optique à domaine de Fourier (FD-OCT)14.

La tomographie par cohérence optique ophtalmique (TCO), un analogue optique de l’imagerie par ultrasons15, utilise l’interférence de la lumière à large bande ou accordable pour générer des coupes optiques de la rétine 16 et du segment antérieur17. Dans l’OCT du domaine temporel, la base des premiers systèmes cliniques, la position d’un miroir de référence est modifiée, de sorte que les modèles d’interférence apparaissent chaque fois que le faisceau de référence a parcouru presque le même temps que le faisceau réfléchi aux différentes interfaces tissulaires, les A-scans étant générés en fonction du temps. Dans la FD-OCT (également appelée OCT spectrale ou domaine fréquentiel), la base de la plupart des systèmes cliniques modernes, le miroir de référence est fixé à une position et un balayage A individuel, avec tous les modèles d’interférence mélangés, est acquis à la fois et disséqué séparément par analyse de Fourier.

Bien que les systèmes cliniques (domaine temporel ou spectral) OCT permettent des vues en coupe transversale de la cornée et la détection d’opacités stromales à une résolution axiale supérieure à celle de la biomicroscopie à lampe à fente, leur résolution latérale est limitée. La microscopie confocale18 permet d’examiner la cornée à une résolution latérale proche du détail histologique, mais est limitée axialement.

La microscopie tomographique par cohérence optique plein champ (FF-OCT ou FF-OCM)19,20 combine des éléments de microscopie confocale et d’OCT, obtenant une résolution latérale comparable à la résolution axiale d’environ 1 μm. Plus précisément, FF-OCM utilise des sources lumineuses à large bande incohérentes (par exemple, une lampe halogène) et une optique à grande ouverture numérique pour acquérir des images tomographiques 2D en face sans balayage latéral. En scannant dans le sens de la profondeur, FF-OCM permet l’imagerie 3D non invasive d’échantillons de tissus biologiques ex vivo frais ou fixes. Il a été utilisé pour imager la cornée21,22,23. En fournissant à la fois des vues haute résolution en face et en coupe transversale, FF-OCM fournit des informations sur la structure histologique et les détails cellulaires de la cornée. En fait, il a été démontré que FF-OCM fournit des informations structurelles supérieures à l’histologie et a été en mesure d’identifier plus d’indicateurs de maladie comme cela était possible avec la combinaison de la TCO dans le domaine spectral et de la microscopie confocale24,25.

Nous décrivons ici un protocole pour l’évaluation qualitative et quantitative du stroma cornéen donneur à l’aide de FF-OCM. La méthode est basée sur l’analyse histologique des caractéristiques macroscopiques et microscopiques indicatives de l’état stromal, y compris trois paramètres stromaux quantitatifs (c.-à-d. l’épaisseur de la couche de Bowman et sa variabilité, et la réflectivité stromale). Le protocole décrit est donc appliqué aux tissus cornéens normaux et anormaux et permet de différencier les tissus cornéens humains malades des tissus cornéens normaux.

Protocol

Toutes les méthodes décrites ici ont été appliquées conformément aux principes de la Déclaration d’Helsinki et ont suivi les exigences éthiques internationales pour les tissus humains. Il s’agissait d’une étude cas-témoins observationnelle prospective. Le consentement éclairé a été obtenu des patients. Aucune modification n’a été apportée aux normes françaises de traitement ou de suivi. L’approbation de la Commission d’examen institutionnel (CISR) a été obtenue auprès du Comité de protection des patients, Ile-de-France V (14944). 1. Sélection et préparation des tissus Sélectionnez les cornées du donneur. Transférer les cornées de donneurs entreposées dans le milieu de culture d’organes 26 dans un milieu de culture d’organes supplémenté en dextron pendant 3 jours pour permettre la déturgescence27 avant l’imagerie FF-OCM28 (voir le tableau des matériaux). Préparez les échantillons. Placez la cornée, immergée dans un milieu de stockage, dans le porte-échantillon avec l’épithélium vers le haut. Placez une lamelle de couverture de silice propre (fournie avec le porte-échantillon) sur le dessus de la cornée et fermez le support en tournant doucement sa base jusqu’à ce que l’échantillon soit légèrement aplati et immobilisé sous le couvercle fournissant une surface d’imagerie relativement uniforme. Prenez des précautions pour éviter toute bulle d’air. Appliquez une épaisse couche de gel ophtalmique ou optique sur la lamelle de couverture comme milieu d’immersion. 2. Initialisation, configuration et acquisition d’images FF-OCM Initialisez l’appareil. Allumez l’appareil en actionnant l’interrupteur d’alimentation à l’arrière de l’appareil; L’éclairage d’une LED verte à l’avant de l’appareil indique que l’appareil est sous tension. Allumez l’ordinateur dédié et la source lumineuse halogène en actionnant l’interrupteur d’alimentation à l’avant. Lancez le logiciel d’acquisition (voir le tableau des matériaux) en double-cliquant sur le raccourci du bureau. Assurez-vous que l’étape d’imagerie est dégagée, sauf pour le plateau mobile. Cliquez ensuite sur « OK » pour initialiser les moteurs à l’invite. Retirez le plateau et insérez le porte-échantillon dans le récipient dédié, puis repoussez doucement le plateau. Configurez l’appareil. Entrez un « identificateur d’échantillon » dans le champ désigné et obligatoire; Entrez éventuellement un « exemple de description » et/ou une « description de l’étude ». Cliquez sur « Acquérir l’image macro » lorsque vous êtes prêt à créer un instantané de l’échantillon qui pourra être utilisé ultérieurement à des fins de positionnement latéral et de navigation. une fois satisfait, validez l’image à l’invite en cliquant sur « Oui », après quoi l’appareil déplace le plateau d’échantillon sous l’objectif et effectue un réglage automatique. Assurez-vous que l’objectif du microscope est bien immergé dans le gel optique avant de continuer. Acquérir les piles. Sélectionnez l’onglet « Explorer » pour préparer une acquisition. Avant d’acquérir une pile d’images, naviguez vers le centre de la cornée, via la traduction du joystick ou la sélection manuelle à l’écran (c’est-à-dire en cliquant et en faisant glisser le carré rouge sur l’image macro acquise à l’emplacement souhaité). Faites varier la profondeur d’imagerie via la rotation du joystick, le réglage du curseur ou la saisie manuelle du clavier dans l’interface utilisateur graphique (GUI) et ajustez la valeur moyenne (une moyenne de 40 est généralement recommandée pour une imagerie cornéenne optimale).REMARQUE: Ceci est fait pour déterminer l’épaisseur de l’échantillon cornéen et la moyenne nécessaire pour imager toute l’épaisseur cornéenne tout en notant la première et la dernière position de l’image en profondeur. La surface inférieure de la lamelle de couverture crée des franges d’interférence parallèles qui sont visibles sur l’image tomographique (sur le côté droit de l’interface graphique), ce qui facilite la localisation de la surface cornéenne. Entrez la valeur de la surface cornéenne ou le premier emplacement de l’image en profondeur dans le champ « Profondeur ». Sélectionnez l’onglet « Acquérir », pour acquérir des images. Sélectionnez l’espacement des tranches (le réglage par défaut et recommandé est de 1 μm, correspondant à la résolution axiale de l’appareil) et entrez la valeur d’épaisseur cornéenne en conséquence, sous « Nombre de tranches ». Passez en revue les paramètres et le temps d’acquisition et, lorsque vous êtes satisfait, appuyez sur « OK » pour lancer l’acquisition. Lors de l’acquisition, évitez tout contact avec la table sur laquelle le FF-OCM est positionné. 3. Gestion des images acquises Affichez et exportez des images. Lancez le logiciel de visualisation FF-OCM (voir le tableau des matières) en double-cliquant sur le raccourci du bureau; les images acquises (identifiées par l’ID de l’échantillon) apparaissent dans la liste « Études locales ». Sélectionnez l’étude avec l’ID d’échantillon correspondant, qui contient à la fois l’image macro et la pile d’images acquise, et « exportez » cette dernière en cliquant avec le bouton droit de la souris sur la série d’images et en sélectionnant le format « DICOM » pour conserver les données brutes et les métadonnées des pixels pour une analyse plus approfondie. Affichez les piles d’images 3D en vue de face et en coupe transversale en utilisant le mode de reconstruction multiplanaire (MPR), en double-cliquant sur la série d’images; Parcourez les images (par exemple, via le défilement de la molette de la souris ou le réglage du curseur) et sélectionnez des vues représentatives en face et en coupe transversale de chaque pile. Exportez les vues sélectionnées en cliquant sur l’icône en bas à droite de la fenêtre, en utilisant le format « DICOM ». Importer des images. Ouvrez le logiciel de traitement d’image (voir le tableau des matériaux) en double-cliquant sur le raccourci du bureau et accédez à « Bio-Formats » « Importer » sous « Plugins » pour importer des images DICOM; assurez-vous que l’option « Regrouper les fichiers avec des noms similaires » est sélectionnée dans la fenêtre « Options d’importation des bioformats ». 4. Analyse d’images : évaluation qualitative et quantitative de la morphologie et des caractéristiques stromales Évaluer l’épaisseur de la couche stromale et de Bowman. Mesurer les distances manuellement sur les coupes transversales cornéennes, par exemple en cinq points également espacés sur la sectiontransversale 25.Tracez une ligne entre deux points de distance connue (comme, de gauche à droite de l’image entière, c’est-à-dire selon le champ de vision par défaut, 1 024 pixels ou 780 μm), allez dans « Analyser » et sélectionnez « Définir l’échelle », entrez la « Distance connue » et « Unité de longueur » dans les champs appropriés et cliquez sur « OK ». Tracez une ligne entre deux points de distance inconnue; Lisez la longueur ou la distance mesurée directement à partir de la barre d’état. Notez la moyenne et le coefficient de variation (COV). L’épaisseur de la couche de Bowman inférieure à 6,5 μm et un COV supérieur à 18,6% ont été associés à un stroma cornéen anormal25. Déterminer la densité des kératopocytes. Suivant la convention de la microscopie confocale: additionner des images stromales en face en groupes de 7 pour produire des tranches d’épaisseur comparable. Pour cela, allez dans l’onglet « Image » et sélectionnez « Reslice Z » sous « Stacks ». Prendre en compte la densité cellulaire différente (décroissante) lors de la progression à travers le stroma24,25. Pour cela, le stroma peut être considéré comme étant composé de 4 régions selon la profondeur : (1) le stroma très antérieur sous la couche de Bowman, soit 2% de l’épaisseur stromale totale ; Le stroma restant (c’est-à-dire 98% de l’épaisseur stromale totale), avec trois zones d’épaisseur identique: (2) stroma antérieur, (3) stroma moyen et (4) stroma postérieur. Pour une analyse plus approfondie, inclure toutes les coupes de face disponibles pour le stroma très antérieur, 15 images pour le stroma antérieur, 5 images pour le stroma moyen, ainsi que 5 images pour le stroma postérieur (où le nombre d’images par région requis pour un comptage fiable a été déterminé par une analyse par étapes29). Sur chaque image de face, sélectionnez une région d’intérêt de 300 μm x 300 μm. Pour améliorer la visualisation du noyau, inversez l’image, en utilisant « Inverser » sous l’onglet « Modifier », et ajustez le contraste et la luminosité. Pour ce dernier, allez dans « Image » et naviguez jusqu’à « Luminosité / Contraste » sous « Analyser ». Compter manuellement les noyaux cellulaires, en utilisant par exemple la fonction « compteur de cellules »25. Pour cela, allez dans « Plugins » et accédez à « Cell Counter » sous « Analyser ». Appuyez sur « initialiser », puis sélectionnez un type de compteur. Ensuite, commencez à compter les noyaux cellulaires en cliquant sur les caractéristiques ovales sombres dans l’image inversée, en considérant ceux qui atterrissent sur une bordure d’image seulement pour deux des quatre côtés de l’image25. Enregistrer la densité cellulaire en termes de densité de surface, c’est-à-dire en cellules/mm² (diviser le nombre de cellules comptées par 0,09, pour convertir des cellules/90 000 μm² en cellules/mm²), conformément à la convention de microscopie confocale où les densités de kératocytes se sont avérées plus faibles chez les patients (par exemple, avec kératocône) que chez les sujets sains et corrélées à la gravité de la maladie25.NOTE: D’autres études cliniques sont nécessaires pour déterminer si un seuil minimal de densité de kératocytes est nécessaire pour obtenir une greffe de cornée parfaitement claire après la transplantation. Évaluer la réflectivité stromale. Générer des profils de profondeur d’intensité moyenne de piles d’images stromales, en utilisant par exemple la fonction « profil de l’axe Z » et/ou un logiciel personnalisé25,30,31.NOTE: Il s’agit en fait de profils de profondeur d’amplitude, car FF-OCM mesure l’amplitude de la lumière rétrodiffusée par l’échantillon plutôt que son intensité.Calculer le niveau de gris moyen pour chaque pile frontale . Soustrayez la valeur grise minimale et normalisez par la valeur de gris maximale. Affichage à l’échelle logarithmique en fonction de la profondeur stromale (% de l’épaisseur stromale). Approximez le profil logarithmique résultant par une droite de régression linéaire, qui minimise la somme des résidus au carré (ajustement des moindres carrés). Notez la valeur R-carré (R²) comme mesure de linéarité. Des valeurs inférieures à 0,94 pourraient être une indication de pathologie cornéenne25.NOTE: Pour différencier l’insuffisance d’un modèle de régression logarithmique linéaire (ou d’un modèle de désintégration mono-exponentielle) due à la présence d’une pathologie du simple bruit de mesure, une analyse du signal par inférence bayésienne peut être effectuée31. En outre, dans les cornées avec des profils de profondeur stromale logarithmiques linéaires (ou mono-exponentielle) (par exemple, représentés par des valeurs R-carré 30 ou des rapports de Birge31 proches de 1), le calcul du trajet sans moyenne des photons à partir du taux de désintégration du signal peut être utilisé pour quantifier davantage le degré de transparence31. Évaluer la visibilité d’autres caractéristiques stromales et indicateurs de maladies. Vérifiez la présence de cicatrices, de tissu fibrotique, de lacs ou de stries de Vogt. Évaluer l’épaisseur moyenne des nerfs dans le stroma, si elle est suffisamment visible pour la mesure24.Sélectionnez une image du visage où le nerf stromal est le plus visible (généralement dans la région du stroma moyen). Mesurez l’épaisseur du nerf, par exemple en cinq points24, puis calculez la moyenne et l’écart-type. Des épaisseurs nerveuses supérieures à 9 μm peuvent être un indicateur supplémentaire de pathologie, comme le kératocône24.

Representative Results

Le dispositif FF-OCM (voir le tableau des matériaux)28 et la configuration générale utilisée dans ce manuscrit sont illustrés à la figure 1. La figure 2 montre une cornée de donneur humain gonflée après stockage dans un milieu de culture d’organes, donnant un modèle physiopathologique de cornée œdémateuse et empêchant l’acquisition d’images FF-OCM sur toute l’épaisseur cornéenne en raison de la profondeur de pénétration limitée. Le transfert dans un milieu de culture d’organes supplémenté en dextran provoque un gonflement et donne des cornées donneuses d’épaisseur normale, comme le montre la figure 3. Les cornées malades peuvent être reconnues par des changements morphologiques et des caractéristiques stromales typiques, y compris une épaisseur réduite et variable du stroma (figure 4) et / ou de la couche de Bowman (figure 5). L’évaluation de la densité des kératocytes (Figure 6) et de la réflectivité stromale (Figure 7) peut également aider à l’analyse histologique et à la différenciation des tissus cornéens normaux des tissus cornéens pathologiques avec FF-OCM, au-delà des capacités des systèmes cliniques OCT (Figure 8). Figure 1 : Schéma et photographies de la configuration générale et du dispositif FF-OCM utilisés dans ce travail. (A) Photographie du dispositif FF-OCM (voir tableau des matériaux)28. (B) Configuration schématique et optique du dispositif. (C) Photographie d’une cornée de donneur humain dans le porte-échantillon. (D) Zoom sur l’objectif d’immersion et le porte-échantillon. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 2 : Cornée humaine normale cultivée en organe avant la déturgescence. Vue en coupe transversale (A) et en face (B, tranche à travers le stroma) de la cornée enflée (« œdémateuse ») causée par le stockage dans un milieu de culture d’organes, où les lacs peuvent être vus comme des zones sombres (comme indiqué par des flèches). L’épaisseur de la cornée a doublé pour atteindre plus de 1 100 μm, empêchant l’acquisition d’images sur toute la profondeur. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 3 : Cornée humaine normale cultivée en organe après déturgescence. Vue en coupe transversale à travers toute la cornée (A) et vue stromale du visage (B) de la cornée dégonflée immergée dans un milieu supplémenté en dextran, montrant des kératocytes hyperréfléchissants (blancs) régulièrement distribués. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 4 : Évaluation globale de la morphologie et des caractéristiques stromales, y compris l’épaisseur du stroma. Par rapport à la cornée humaine normale (A), les cornées à kératocône (B) présentent une épaisseur stromale réduite et variable, ainsi que de nombreuses stries Vogt parallèles observables sous forme de bandes verticales sombres dans les vues transversales et des nerfs stromaux épais que l’on peut trouver dans les tranches du milieu du stroma (C). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 5 : Évaluation de l’épaisseur de la couche de Bowman, qui est délimitée antérieurement par la membrane basale épithéliale hyperréfléchissante et postérieurement par les kératocytes hyperréfléchissants du stroma très antérieur. Par rapport à une cornée humaine normale (A), la cornée pathologique (p. ex. kératocône) (B) présente une épaisseur de couche de Bowman réduite et variable en raison de l’interruption et des cicatrices. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 6 : Évaluation de la densité des kératopocytes. (A) Les noyaux de kératocytes sont comptés manuellement sur des images de face améliorées et inversées après sélection d’une région d’intérêt de 300 μm x 300 μm. (B) Les noyaux comptés sont indiqués par des flèches. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 7 : Évaluation de la réflectivité stromale. La quantité de lumière rétrodiffusée diminue (exponentiellement) avec la profondeur dans le stroma des cornées donneuses normales (voir Figure 3 et Figure 4A), ce qui donne des profils de profondeur logarithmiques linéaires, représentés par des valeurs R-carré proches de 1 (trace verte). Cela peut ne pas être vrai pour les cornées pathologiques présentant des régions stromales de rétrodiffusion accrue de la lumière (voir Figure 4B). La présence de telles caractéristiques macroscopiques, comme dans l’exemple d’une cornée avec cicatrice stromale après kératite infectieuse (représentée dans l’encadré), créera donc des profils de profondeur d’intensité logarithmique non linéaires, représentés par une valeur R-carré inférieure à un certain seuil (par exemple, inférieure à 0,9425; trace rouge). Notez que les profils de profondeur d’amplitude logarithmique sont en fait montrés lorsque FF-OCM mesure l’amplitude de la lumière rétrodiffusée par l’échantillon plutôt que son intensité.  Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 8 : Démonstration des avantages de la FF-OCM par rapport à l’histologie et à l’OCT du domaine spectral. (A) histologie et (B) image correspondante de domaine spectral-OCT acquise sur la même cornée in vivo avant kératoplastie. (C) Coupe efficace FF-OCM correspondante du bouton cornéen ex vivo post-kératoplastie, illustrant une résolution supérieure par rapport aux images OCT du domaine spectral clinique. La fibrose est également plus clairement visible dans les images FF-OCM que dans l’histologie. La forte densité de kératocytes dans le stroma supérieur peut être clairement visible à la fois dans la coupe transversale (C) et (D) en face . Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Le protocole décrit ici pour l’évaluation qualitative et quantitative du stroma donneur cornéen à l’aide de FF-OCM est basé sur l’analyse histologique des caractéristiques macroscopiques et microscopiques indicatives de l’état stromal, au-delà des capacités de la TCO du domaine spectral et de la microscopie confocale21,24,25, et permet de différencier les tissus humains malades des tissus humains normaux.

Outre une excellente évaluation de la qualité endothéliale des cornées de donneurs humains au moyen de la microscopie spéculaire, l’évaluation de la qualité stromale est difficile dans les banques oculaires et se limite généralement à une observation grossière avec la biomicroscopie à lampe à fente et / ou la microscopie optique dans les protocoles actuels. L’absence de résolution fine avec les méthodes existantes signifie non seulement que des cornées atteintes d’une maladie stromale peuvent être sélectionnées qui compromettent le résultat de la kératoplastie, mais aussi que les cornées peuvent être rejetées pour des opacités stromales qui sont en fait une contrainte au stroma antérieur ou aux régions épithéliales et pourraient encore être utilisées pour les procédures de kératoplastie endothéliale14.

Le protocole actuel de banque oculaire pourrait être complété par l’ajout de FF-OCM, qui, en raison de sa résolution supérieure, constitue un outil puissant et non invasif pour compléter l’évaluation de la qualité de la cornée, en particulier du stroma (y compris la couche de Bowman). Contrairement à l’examen à la lampe à fente, le greffon reste immergé dans une chambre fermée remplie de support de stockage tout au long de l’acquisition d’images FF-OCM, ce qui diminue tout risque potentiel de contamination.

Pour une acquisition d’image réussie avec FF-OCM (voir Tableau des matériaux), il est important que l’objectif du microscope soit bien immergé dans le gel optique qui est appliqué sur le couvercle du porte-échantillon (étape 2.2.3). Il est en outre recommandé de vérifier régulièrement l’étalonnage de l’appareil, une procédure qui doit également être effectuée après un réglage automatique infructueux (étape 2.2.2) et accessible via « Outils et options » dans le logiciel d’acquisition (voir Tableau des matériaux). La procédure, qui implique l’utilisation d’un miroir d’étalonnage dans le porte-échantillon, est la même que la préparation habituelle de l’échantillon (voir étape 1.2), sauf que le gel optique doit être appliqué sur le miroir avant le positionnement du couvercle.

Une série de greffes de cornée de donneur, considérées comme ayant un stroma normal selon les procédures de banque oculaire existantes, ont été utilisées pour décrire le protocole dans ce manuscrit et démontrer spécifiquement la pertinence de FF-OCM pour une évaluation précise et fiable de la qualité stromale du donneur. Ces cornées normales de donneurs ont été comparées à des cornées pathologiques immergées dans un milieu de stockage, montrant que l’analyse histologique rendue possible avec FF-OCM de plusieurs caractéristiques stromales (illustrées dans Figure 2, Figure 3, Figure 4, Figure 5, Figure 6, Figure 7 et Figure 8) dans les greffes cornéennes permet de distinguer les tissus cornéens humains malades des tissus cornéens normaux.

Outre les changements morphologiques, tels que la présence de cicatrices (Figure 5 et Figure 7), de tissu fibrotique (Figure 8), de lacs (Figure 2), de stries Vogt (Figure 4) ou d’augmentation du diamètre du nerf stromal (Figure 4), des caractéristiques stromales typiques sont présentes dans les cornées malades. Les paramètres stromaux particulièrement pertinents dans l’évaluation de la qualité stromale semblent être l’épaisseur de la couche de Bowman et sa variabilité, ainsi que la réflectivité stromale. Les étapes critiques du protocole sont donc les étapes 4.1 et 4.3.

Tout en étant sécrétée pendant le développement de la cornée humaine, la couche de Bowman, en particulier, se distingue à 19 semaines de gestation et ne se répare jamais après la naissance32. Les dommages à la couche de Bowman sont donc irréversibles et servent d’indicateur idéal des dommages stromaux antérieurs dans le tissu cornéen du donneur, y compris les dommages causés par la chirurgie réfractive, la kératite infectieuse, le kératocône. De telles maladies cornéennes, qui constituent des contre-indications à l’utilisation de la cornée du donneur, sont associées à une diminution et à une variation de l’épaisseur de la couche de Bowman en raison de l’interruption et de la cicatrisation (figure 5), et sont susceptibles d’être ignorées par les protocoles actuels de banque oculaire lorsque l’historique du donneur n’est pas connu avec précision.

Bien que la transparence cornéenne soit altérée après le décès du donneur en raison d’un œdème cornéen post mortem , la quantité de lumière rétrodiffusée ou réflectivité stromale devrait diminuer exponentiellement avec la profondeur dans le stroma (voir la figure 3 et la figure 4A); en conséquence, le logarithme de la réflectivité stromale normalisée sera une fonction linéaire de la profondeur stromale dans les cornées normales du donneur, représentée par des valeurs R-carré proches de 1. Inversement, la présence de caractéristiques macroscopiques est associée à des profils de profondeur logarithmiques non linéaires et indique une maladie stromale (Figure 4B et Figure 7)25.

Étant donné que la densité des kératocytes est responsable de la synthèse et du renouvellement du fibrille de collagène stromal et de la matrice extracellulaire, il semble raisonnable de supposer que la densité des kératocytes est un autre paramètre pertinent pour évaluer la qualité stromale du donneur et que les tissus présentant un très faible nombre de kératocytes ne devraient pas être transplantés. Le protocole comprend donc une méthode précise et fiable pour mesurer la densité des kératocytes à partir d’images FF-OCM qui peut être facilement utilisée dans les banques oculaires25 et suit la convention de la microscopie confocale. Notez qu’avec FF-OCM, la densité des kératocytes peut également être déterminée en comptant les kératocytes directement dans la vue transversale33, un avantage potentiel par rapport à la microscopie confocale, qui nécessite que les kératocytes soient comptés sur plusieurs tranches faciales. Cependant, contrairement aux patients vivants, où il a été démontré que les densités de kératocytes étaient plus faibles chez les patients atteints de la maladie que chez les témoins normaux 34,35,36,37 et qu’elles étaient corrélées avec la gravité de la maladie 34,38, ce n’était pas le cas dans les échantillons de tissus humains ex vivo 25 , et d’autres études sont nécessaires pour déterminer si un nombre minimal de kératocytes est nécessaire dans les cornées des donneurs pour entraîner une bonne récupération visuelle après la transplantation. La faible densité de kératocytes dans les tissus donneurs comme dans les tissus pathologiques pourrait s’expliquer par le vieillissement, la perte post mortem de cellules induite par l’ischémie et/ou le stockage des tissus donneurs 27,39,40,41. Il convient également de souligner que les cornées normales du donneur qui ont été obtenues et imagées dans ce protocole étaient soit stockées et œdémateuses ou dégonflées, soit avaient été jetées par la banque d’yeux avant la transplantation en raison d’une mauvaise qualité endothéliale selon les normes de l’Association européenne des banques d’yeux. Si l’imagerie FF-OCM avec le protocole décrit devait être inclus dans la banque d’yeux, les cornées seraient généralement évaluées dans un état plus frais que ce qui est possible ici, ce qui peut affecter les densités de kératopocytes.

Le protocole décrit ici pour l’analyse de la qualité stromale pourrait être étendu à l’évaluation de la membrane de Descemet, qui peut également être résolue avec FF-OCM en termes d’épaisseur et de structure21,24. Cela peut s’avérer utile pour la sélection des tissus pour la kératoplastie endothéliale membranaire de Descemet, où les membranes minces de Descemet peuvent être plus difficiles à séparer du stroma.

En conclusion, FF-OCM permet une évaluation précise et fiable du stroma cornéen du donneur humain pendant le stockage. En améliorant la qualité du greffon, l’ajout de ce protocole aux procédures actuelles de banque oculaire a le potentiel d’améliorer le dépistage et la sélection des tissus du donneur, et donc les résultats de la kératoplastie. L’intégration réelle du dispositif FF-OCM dans la routine de la banque oculaire devrait être facilitée par les récentes mises à jour technologiques, y compris une acquisition d’image plus rapide et un champ de vision plus large grâce au développement d’une caméra CMOS personnalisée, et la conception de cassettes jetables stériles personnalisées pour le stockage et la manipulation de la cornée pendant l’imagerie.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ces travaux ont reçu un financement de l’Agence Nationale de Recherche (ANR), dans le cadre d’une subvention PRTS (Projet de Recherche Translationelle en Santé) n° ANR-13-PRTS-0009 (V.B.) et du programme de recherche et d’innovation Horizon 2020 de l’Union européenne dans le cadre de la convention de subvention Marie Skłodowska-Curie n° 709104 (K.I.). Les auteurs remercient Céline de Sousa pour son aide dans le comptage cellulaire et le traitement histologique.

Materials

Light-CT Scanner LLTech, France http://www.lltechimaging.com/products-applications/products/ FF-OCM device used in this manuscript for imaging
CorneaJet EuroBio, France http://www.eurobio-cornea.com/en/corneamax-10-100-ml-xml-352-822.html Organ culture medium in which donor corneas are stored
CorneaMax EuroBio, France http://www.eurobio-cornea.com/en/corneajet-10-50-ml-xml-352-823.html Dextran-supplemented organ culture medium used for deturgescence 
Fiji (ImageJ) National Institute of Health, Bethesda, MD, USA https://fiji.sc/ Open source image processing software
Matlab Mathworks, Inc., Natick, MA, USA https://www.mathworks.com/products/matlab.html Mathematical computing software
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CorneaCorneal GraftOptical Coherence MicroscopyHistologyStromal FeaturesEye BanksCornea TransplantationHigh ResolutionImmersion MediumSample HolderCover SlipGreen LEDAcquisition SoftwareMacro ImageAuto-adjustmentJoystickDepth AdjustmentAveragingCorneal Surface

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Irsch, K., Grieve, K., Borderie, M., Vilbert, M., Plamann, K., Ghoubay, D., Georgeon, C., Borderie, V. Full-Field Optical Coherence Microscopy for Histology-Like Analysis of Stromal Features in Corneal Grafts. J. Vis. Exp. (188), e57104, doi:10.3791/57104 (2022).
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