Summary

Isolamento di cellule dendritiche dal tratto riproduttivo femminile umano per studi fenotipici e funzionali

Published: March 13, 2018
doi:

Summary

Descriviamo qui un metodo per isolare e purificare le cellule dendritiche da diversi compartimenti anatomici nel tratto riproduttivo femminile umano per la valutazione delle loro caratteristiche fenotipiche e funzionali. Questo metodo può essere adattato per isolare altre cellule immuni o cellule dendritiche da altri tessuti mucosi.

Abstract

La caratterizzazione di umane cellule dendritiche (DCs) residente in tessuti mucosi è impegnativa a causa della difficoltà nell’ottenere i campioni, e i numeri bassi dei controller di dominio presentano al tessuto. Eppure, come il fenotipo e la funzione di controller di dominio viene modificato dall’ambiente del tessuto, è necessario analizzare le popolazioni residenti di DC del tessuto, poiché sangue derivati DCs in modo incompleto riflettere la complessità del DCs nei tessuti. Qui presentiamo un protocollo per isolare DCs da umano tratto riproduttivo femminile (FRT) utilizzando esemplari di isterectomia che permette analisi sia fenotipiche e funzionali. Il protocollo è costituito da digestione del tessuto per generare una singola cellula miscelati sospensione cellulare, seguita da una selezione positiva biglie magnetiche. Il nostro protocollo di digestione del tessuto non fendere gli indicatori di superficie, che permette l’analisi fenotipica e funzionale di DCs in regime stazionario, senza attivazione di incubazione o cella durante la notte. Questo protocollo può essere adattato per l’isolamento di altri tipi di cellule immunitarie o di DCs da altri tessuti.

Introduction

La FRT ha la duplice funzione di protezione contro gli agenti patogeni consentendo l’impianto e la gravidanza1. A tale scopo, è suddiviso in compartimenti la FRT, con ogni regione anatomica visualizzati uniche caratteristiche istologiche, immunologiche e funzionale1.

Controller di dominio presenti alle superfici mucose prendere contatto con i microbi nel polmone, intestino e del tratto genitale e fornire sorveglianza immune per potenziali agenti patogeni2. Controller di dominio hanno la capacità unica di adescare ingenuo T-cellule e innescare risposte immunitarie3. Controller di dominio nella FRT sono specializzati anche per tollerare antigeni estranei, come quelli trovati in sperma e lo sviluppo del feto, per consentire la riuscita gravidanza4. Pertanto, a seconda della posizione, la DC fenotipo e la funzione sarà distinti. È noto che DCs sono fortemente influenzati dall’ambiente di tessuto, tale che il loro numero, il fenotipo e la funzionalità vengono modificate dall’ambiente del tessuto in cui risiedono3. Pertanto, per comprendere il ruolo nelle malattie infettive, gravidanza e cancro nella FRT FRT DCs, DCs residenti devono essere studiati, dal sangue e modelli derivati DC sono insufficienti ad affrontare le complessità normative trovate nei tessuti FRT.

La caratterizzazione di tessuti umani residenti DCs è impegnativo a causa del basso numero di cellule presenti nei tessuti mucosi e la difficoltà di ottenere campioni di tessuto umano. Controller di dominio sono stati studiati in FRT usando immunohistochemistry5,6, che informa circa la posizione di cella all’interno del tessuto, ma esclude gli studi funzionali e viene limitato il numero di identificazione di marcatori di cellule che possono essere analizzati in una sola volta. Inoltre, i protocolli di isolamento di singola cellula per l’analisi cytometric di flusso sono stati sviluppati7,8,9. Alcuni di questi protocolli approfitta della capacità migratoria del DCs per isolare quelle cellule che migrano. Questi metodi solitamente richiedono incubazioni overnight e selezione di DC attivate, ma non consentono per lo studio dei controller di dominio nello stato di stabilità.

Qui, utilizzando esemplari di isterectomia, abbiamo ottimizzato un protocollo per isolare DCs da diverse sedi anatomiche in FRT, l’endometrio (EM), l’endocervice (CX) e l’esocervice (ECX), che consente analisi sia fenotipiche e funzionali. Utilizza un protocollo non proteolitico digestione enzimatica, possiamo procedere immediatamente dopo la digestione del tessuto alla caratterizzazione di cella isolamento e flusso cytometric senza l’attivazione delle cellule. Mediante citometria a flusso multicolor e adattando gli studi funzionali per un basso numero di cellule, possiamo identificare e caratterizzare rare sottoinsiemi di controller di dominio in diversi siti della FRT

Protocol

Secondo i principi espressi nella dichiarazione di Helsinki sono stati condotti studi che coinvolgono soggetti umani. Gli studi sono stati approvati da Dartmouth College Institutional Review Board e il Comitato per la protezione di soggetti umani (CPHS). Consenso informato è stato ottenuto prima dell’intervento chirurgico da HIV-negativi donne sottoposte a isterectomia a Dartmouth-Hitchcock Medical Center (Lebanon, NH). I patologi addestrati selezionati campioni di tessuto dal EM, CX ed ECX, privo di lesioni anatomo-pat…

Representative Results

Seguente digestione del tessuto, il rilascio di strati epiteliali e ghiandole può essere osservata, come mostrato in Figura 1A; si tratta di un controllo positivo che indica che la digestione enzimatica è stata completata. Il numero di cellule vitali totale e DCs recuperato per grammo di tessuto è anche mostrato in Figura 1B e Figura 1, rispettivamente. Cellule del sistema immunitario rappresentan…

Discussion

DCs mucoso sono una popolazione di cellule rare fortemente influenzata dall’ambiente del tessuto, che cambia il loro fenotipo e la funzione una volta entrati i tessuti3. Mentre il sangue derivate DCs sono un modello molto utile, non rappresentano pienamente la diversità delle popolazioni DC trovati nei tessuti. Pertanto, per capire le caratteristiche uniche del DCs mucoso, isolamento di cellule primarie da tessuti è necessario. Isolamento di DCs da diverse sedi anatomiche nella FRT offre l’oppor…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

I borse di studio supportato da NIH AI102838 e AI117739 (CRW). Si ringrazia Richard Rossoll per assistenza tecnica. L’analisi cytometric di flusso è stato effettuato in DartLab, la risorsa condivisa alle Dartmouthsupported di (P30CA023108-37) e (P30GM103415-15).

Materials

Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Hyclone SH30015.03
Penicillin-streptomycin Hyclone SV30010
HEPES (1M) Hyclone 15630-080
Collagenase IV Sigma C5138
Deoxyribonuclease I Worthington Biochemical LS002140
D-glucose Sigma Aldritch 50-99-7
0.22 um Stericup 500 mL  filter Millipore SCGPU05RE
100mm x 15mm polystyrene petri dish Fisherbrand FB0875712
150mm x 15mm polystyrene petri dish Fisherbrand FB0875714
150mm x 25mm polystyrene dish Corning 430599 Treated cell culture dish
Isotemp Incubator Fisher Scientific FICO3500TABB 5.0% CO2
American Rotator V American DADE R4140
250 um nylon mesh Sefar 03-250/50
20 um nylon mesh Sefar 03-20/14
Beckman GS-6R Centrifuge Beckman 358702
X-VIVO 15 with Gentamicin L-Gln, Phenol Red, 1 L Lonza 04-418Q
Human AB Serum Valley Biomedical HP1022
Histopaque-1077 Sigma Aldritch 10771
Phosphate Buffer Solution (PBS) National Diagnostics CL-253 pH 7.4
Dead Cell Removal Kit Miltenyi Biotec 130-090-101
Pre-separation filter (30um) Miltenyi Biotec 130-041-407
LS column Miltenyi Biotec 130-042-410
Quadro MACS Separator Miltenyi Biotec 130-090-976
MACS multi-stand Miltenyi Biotec 130-042-303
EDTA USB 15694
CD1a Microbeads, human Miltenyi Biotec 130-051-001
CD14 Microbeads, human Miltenyi Biotec 130-050-201
eFluor 670 cell proliferation dye eBiosciences 65-0840-85
96 well round bottom plate Falcon 9/8/2866
Zombie yellow viability dye Biolegend 423104
CD3 APC/Cy7, anti-human Tonbo Biosciences 25-0038-T100
CD4 PE, anti-human eBiosciences 12-0048-42
CD8a FITC, anti-human Tonbo Biosciences 35-0086-T100
Gallios Flow Cytometer Beckman Coulter Life Sciences B43618 10 color, VBR
MACSquant Analyzer 10 Miltenyi Biotec 130-096-343 8 color, VBR

References

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Cite This Article
Rodriguez-Garcia, M., Fortier, J. M., Barr, F. D., Wira, C. R. Isolation of Dendritic Cells from the Human Female Reproductive Tract for Phenotypical and Functional Studies. J. Vis. Exp. (133), e57100, doi:10.3791/57100 (2018).

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