Isolation von dendritischen Zellen aus menschlichen weiblichen Fortpflanzungsorgane für phänotypische und funktionelle Studien
Summary
Wir beschreiben hier eine Methode um zu isolieren und reinigen von dendritischen Zellen aus verschiedenen anatomischen Fächer in der menschlichen weiblichen Fortpflanzungsorgane für die Bewertung ihrer phänotypischen und funktionellen Eigenschaften. Diese Methode kann zu anderen Immunzellen oder dendritische Zellen aus anderen Schleimhaut-Gewebe isolieren angepasst werden.
Abstract
Die Charakterisierung der menschlichen dendritischen Zellen (DCs) Wohnsitz in Schleimhaut-Gewebe ist schwierig wegen der Schwierigkeiten bei der Beschaffung von Proben und die geringe Zahl von DCs pro Gewebe zu präsentieren. Doch wie der Phänotyp und die Funktion der DCs wird durch das Gewebe Umfeld geändert, ist es notwendig zu analysieren Gewebe Wohnbevölkerung DC, da Blut DCs nicht vollständig abgeleitet spiegeln die Komplexität des DCs in Geweben. Hier präsentieren wir ein Protokoll, um DCs aus der menschlichen weiblichen Fortpflanzungsorgane (FRT) mit Hysterektomie zu isolieren, die phänotypische und funktionelle Analysen ermöglicht. Das Protokoll besteht aus Gewebe Verdauung um eine einzelne Zelle gemischt Zellsuspension, gefolgt von positive magnetische Bead Auswahl zu generieren. Unsere Gewebe-Verdauung-Protokoll wird nicht Oberflächenmarker, cleave, wodurch phänotypische und funktionelle Analyse der DCs in der Steady-State, ohne Übernachtung Inkubationszeit oder Zelle Aktivierung. Dieses Protokoll kann für die Isolierung von anderen Immunzellen Typen oder Isolierung von DCs aus anderen Geweben angepasst werden.
Introduction
Die FRT hat die doppelte Funktion der Schutz gegen Krankheitserreger gleichzeitiger Implantation und Schwangerschaft1. Um dies zu erreichen, ist die FRT mit jeder anatomischen Region anzeigen histologischen, immunologische und funktionalen Besonderheiten1zersplittert.
DCs bei Schleimhaut-Oberflächen machen Kontakt mit Mikroben in der Lunge, Darm und Genitalbereich, und bieten Immunüberwachung für potenzielle Krankheitserreger2. DCs haben die einzigartige Fähigkeit, prime naive T-Zellen und adaptive Immunantworten3auslösen. DCs in der FRT sind auch darauf spezialisiert, um fremde Antigene, z. B. auf Sperma und den sich entwickelnden Fötus, ermöglichen erfolgreiche Schwangerschaft4zu dulden. Daher, je nach Standort, DC Phänotyp und Funktion deutlich werden. Es ist bekannt, dass DCs stark von der Gewebe beeinflusst sind, so dass ihre Anzahl, Phänotyp und Funktionen durch das Gewebe Umfeld geändert werden in denen sie3wohnen. Daher müssen um die Rolle zu verstehen, die FRT DCs bei ansteckenden Krankheiten, Schwangerschaft und Krebs in der FRT spielen, ansässige DCs zu untersuchenden abgeleiteten DC-Modelle nicht ausreichen sind, um die regulatorischen Komplexität in FRT Geweben gefunden zu adressieren, da Blut.
Die Charakterisierung des menschlichen Gewebes ansässige DCs ist schwierig, aufgrund der geringen Zahl von Zellen im Schleimhaut-Gewebe und die Schwierigkeit, die Erlangung menschlichen Gewebeproben. DCs sind untersucht worden, in der FRT mittels Immunhistochemie5,6, die informiert über die Zellenposition innerhalb des Gewebes, sondern schließt funktionelle Studien und beschränkt die Zahl der Identifizierung Zelle Marker, die analysiert werden können auf einmal. Darüber hinaus wurden einzelne Zelle isoliert Protokolle für durchflusszytometrischen Analyse entwickelten7,8,9. Einige dieser Protokolle nutzen die wandernden Kapazität des DCs, die Zellen zu isolieren, die migrieren. Diese Methoden in der Regel über Nacht Inkubationen und Auswahl der aktivierten DCs erfordern, aber lassen Sie nicht für das Studium der DCs in der Steady-State.
Hier, mit Hysterektomie, wir ein Protokoll, um DCs von verschiedenen anatomischen Standorten in den FRT der Gebärmutterschleimhaut (EM), isolieren optimiert die Endocervix (CX) und des Ectocervix (ECX), die phänotypische und funktionelle Analysen ermöglicht. Ein nicht-proteolytischen enzymatische Verdauung-Protokoll verwenden, können wir sofort nach Gewebe Verdauung zu Zelle isoliert und Flow durchflusszytometrischen Charakterisierung ohne Zellaktivierung fortfahren. Mit mehrfarbigen Durchflusszytometrie und Anpassung funktionelle Studien für eine geringe Anzahl von Zellen, wir erkennen und charakterisieren seltene Teilmengen von DCs in den verschiedenen Standorten der FRT
Protocol
Representative Results
Discussion
Schleimhaut DCs sind eine seltene Zellpopulation stark beeinflusst durch die Gewebe-Umgebung, die deren Phänotyp und Funktion ändert, sobald sie das Gewebe3geben Sie. Während Blut abgeleitet DCs sind ein sehr nützliches Modell, sie repräsentieren nicht voll die Vielfalt der DC-Populationen in Geweben gefunden. Deshalb, um die einzigartigen Eigenschaften der Schleimhaut DCs zu verstehen, ist Isolierung von Primärzellen von Gewebe notwendig. Isolierung von DCs von verschiedenen anatomischen St…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Studie von NIH unterstützt AI102838 und AI117739 (CRW) gewährt. Wir danken Richard Rossoll für technische Hilfe. Durchflusszytometrischen Analyse erfolgte in DartLab, die gemeinsame Ressource am Dartmouthsupported (P30CA023108-37) und (P30GM103415-15).
Materials
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Hyclone | SH30015.03 | |
| Penicillin-streptomycin | Hyclone | SV30010 | |
| HEPES (1M) | Hyclone | 15630-080 | |
| Collagenase IV | Sigma | C5138 | |
| Deoxyribonuclease I | Worthington Biochemical | LS002140 | |
| D-glucose | Sigma Aldritch | 50-99-7 | |
| 0.22 um Stericup 500 mL filter | Millipore | SCGPU05RE | |
| 100mm x 15mm polystyrene petri dish | Fisherbrand | FB0875712 | |
| 150mm x 15mm polystyrene petri dish | Fisherbrand | FB0875714 | |
| 150mm x 25mm polystyrene dish | Corning | 430599 | Treated cell culture dish |
| Isotemp Incubator | Fisher Scientific | FICO3500TABB | 5.0% CO2 |
| American Rotator V | American DADE | R4140 | |
| 250 um nylon mesh | Sefar | 03-250/50 | |
| 20 um nylon mesh | Sefar | 03-20/14 | |
| Beckman GS-6R Centrifuge | Beckman | 358702 | |
| X-VIVO 15 with Gentamicin L-Gln, Phenol Red, 1 L | Lonza | 04-418Q | |
| Human AB Serum | Valley Biomedical | HP1022 | |
| Histopaque-1077 | Sigma Aldritch | 10771 | |
| Phosphate Buffer Solution (PBS) | National Diagnostics | CL-253 | pH 7.4 |
| Dead Cell Removal Kit | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
| Pre-separation filter (30um) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| LS column | Miltenyi Biotec | 130-042-410 | |
| Quadro MACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| MACS multi-stand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| EDTA | USB | 15694 | |
| CD1a Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-051-001 | |
| CD14 Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | |
| eFluor 670 cell proliferation dye | eBiosciences | 65-0840-85 | |
| 96 well round bottom plate | Falcon | 9/8/2866 | |
| Zombie yellow viability dye | Biolegend | 423104 | |
| CD3 APC/Cy7, anti-human | Tonbo Biosciences | 25-0038-T100 | |
| CD4 PE, anti-human | eBiosciences | 12-0048-42 | |
| CD8a FITC, anti-human | Tonbo Biosciences | 35-0086-T100 | |
| Gallios Flow Cytometer | Beckman Coulter Life Sciences | B43618 | 10 color, VBR |
| MACSquant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | 130-096-343 | 8 color, VBR |
References
- Wira, C. R., Rodriguez-Garcia, M., Patel, M. V. The role of sex hormones in immune protection of the female reproductive tract. Nat Rev Immunol. 15 (4), 217-230 (2015).
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).
- Schlitzer, A., McGovern, N., Ginhoux, F. Dendritic cells and monocyte-derived cells: Two complementary and integrated functional systems. Semin Cell Dev Biol. 41, 9-22 (2015).
- Tagliani, E., Erlebacher, A. Dendritic cell function at the maternal-fetal interface. Expert Rev Clin Immunol. 7 (5), 593-602 (2011).
- Kaldensjo, T., et al. Detection of intraepithelial and stromal Langerin and CCR5 positive cells in the human endometrium: potential targets for HIV infection. PLoS One. 6 (6), e21344 (2011).
- Schulke, L., Manconi, F., Markham, R., Fraser, I. S. Endometrial dendritic cell populations during the normal menstrual cycle. Hum Reprod. 23 (7), 1574-1580 (2008).
- Ballweber, L., et al. Vaginal langerhans cells nonproductively transporting HIV-1 mediate infection of T cells. J Virol. 85 (24), 13443-13447 (2011).
- Hladik, F., et al. Initial events in establishing vaginal entry and infection by human immunodeficiency virus type-1. Immunity. 26 (2), 257-270 (2007).
- Duluc, D., et al. Functional diversity of human vaginal APC subsets in directing T-cell responses. Mucosal Immunol. 6 (3), 626-638 (2013).
- Herzenberg, L. A., Tung, J., Moore, W. A., Parks, D. R. Interpreting flow cytometry data: a guide for the perplexed. Nat Immunol. 7 (7), 681-685 (2006).
- Juno, J. A., Boily-Larouche, G., Lajoie, J., Fowke, K. R. Collection, isolation, and flow cytometric analysis of human endocervical samples. J Vis Exp. (89), (2014).
- Givan, A. L., et al. Flow cytometric analysis of leukocytes in the human female reproductive tract: comparison of fallopian tube, uterus, cervix, and vagina. Am J Reprod Immunol. 38 (5), 350-359 (1997).
- Rodriguez-Garcia, M., et al. Dendritic cells from the human female reproductive tract rapidly capture and respond to HIV. Mucosal Immunol. 10 (2), 531-544 (2017).
- Rodriguez-Garcia, M., Barr, F. D., Crist, S. G., Fahey, J. V., Wira, C. R. Phenotype and susceptibility to HIV infection of CD4+ Th17 cells in the human female reproductive tract. Mucosal Immunol. 7 (6), 1375-1385 (2014).
- Shen, Z., Rodriguez-Garcia, M., Ochsenbauer, C., Wira, C. R. Characterization of immune cells and infection by HIV in human ovarian tissues. Am J Reprod Immunol. , (2017).
