Summary

Isolamento de células dendríticas do tracto reprodutivo feminino humano para estudos fenotípica e funcionais

Published: March 13, 2018
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Summary

Descrevemos aqui um método para isolar e purificar as células dendríticas de diferentes compartimentos anatômicas no aparelho reprodutor feminino humano para a avaliação de suas características fenotípica e funcionais. Esse método pode ser adaptado para isolar outras células do sistema imunológico ou células dendríticas de outros tecidos da mucosa.

Abstract

A caracterização das humano as células dendríticas (DCs) residentes nos tecidos da mucosa é um desafio devido à dificuldade na obtenção de amostras e o baixo número de DCs presentes por tecido. Ainda, como o fenótipo e a função de DCs é modificado pelo ambiente de tecido, é necessário analisar as populações residentes de tecido DC, desde sangue derivado DCs incompleta refletem as complexidades de DCs em tecidos. Aqui nós apresentamos um protocolo para isolar DCs de humano feminino trato reprodutivo (FRT) usando amostras de histerectomia que permite análise fenotípica e funcional. O protocolo é composto por digestão do tecido para gerar uma única célula misturado a suspensão de células, seguido pela seleção de grânulo magnética positiva. Nosso protocolo de digestão do tecido não cleave marcadores de superfície, que permite a análise fenotípica e funcional de DCs no estado estacionário, sem ativação de incubação ou celular durante a noite. Este protocolo pode ser adaptado para o isolamento de outros tipos de células imunes ou isolamento de DCs de outros tecidos.

Introduction

A FRT tem a dupla função de proteger contra patógenos, permitindo a implantação e gravidez1. Para realizar isto, a FRT é compartimentada, com cada região anatômica, mostrando características histológicas, imunológicas e funcional1.

DCs presentes em superfícies mucosas fazem contato com micróbios no pulmão, intestino e do trato genital e fornecer vigilância imune para potenciais patógenos2. DCs têm a capacidade única de prime ingênuo células T e desencadear respostas imunes adaptáveis3. DCs no FRT também são especializados para tolerar a antígenos estranhos, tais como aqueles encontrados no esperma e o desenvolvimento do feto, para permitir que a gravidez bem sucedida4. Portanto, dependendo da localização, o fenótipo de DC e a função será distintos. É conhecido que DCs são fortemente influenciados pelo ambiente de tecido, tal que o seu número, fenótipo e funções são modificadas pelo ambiente de tecido em que residem3. Portanto, para entender o papel que FRT DCs desempenham na gravidez, doenças infecciosas e câncer no FRT, DCs residentes precisam ser estudados, desde sangue derivada DC modelos são insuficientes para resolver as complexidades regulamentares encontradas em tecidos FRT.

A caracterização do tecido humano residentes DCs é um desafio devido ao baixo número de células presentes nos tecidos da mucosa e a dificuldade de obtenção de amostras de tecido humano. DCs têm sido estudadas no FRT usando immunohistochemistry5,6, que informa sobre a localização da célula dentro do tecido, mas se opõe a estudos funcionais e é limitado o número de identificação de marcadores de células que podem ser analisados ao mesmo tempo. Além disso, os protocolos de isolamento única célula para análise de fluxo cytometric foram desenvolvidos7,8,9. Alguns desses protocolos tirar proveito da capacidade migratória do DCs para isolar as células que migram. Esses métodos normalmente exigem a incubação do durante a noite e seleção de DCs ativados, mas não permitem o estudo da DCs no estado estacionário.

Aqui, usando amostras de histerectomia, nós aperfeiçoamos um protocolo para isolar DCs em locais anatômicos diferentes no FRT, o endométrio (EM), a endocérvice (CX) e a ectocérvice (ECX), que permite a análise fenotípica e funcional. Usando um protocolo não-proteolíticas digestão enzimática, podemos prosseguir imediatamente após a digestão do tecido celular isolamento e fluxo cytometric uma caracterização sem ativação de células. Utilizando citometria de fluxo multicolor e adaptação de estudos funcionais para baixo número de células, nós podemos identificar e caracterizar raros subconjuntos de DCs em diferentes locais do Frist

Protocol

Estudos envolvendo seres humanos foram conduzidos de acordo com os princípios expressados na declaração de Helsinque. Estudos foram aprovados pelo Conselho de revisão institucional Dartmouth College e o Comitê para a proteção de assuntos humanos (CPHS). Termo de consentimento informado foi obtido antes da cirurgia seronegativo mulheres passando por histerectomia no Dartmouth-Hitchcock Medical Center (Líbano, NH). Patologistas treinados selecionadas amostras de tecido da EM, CX e ECX, livre de lesões patológicas…

Representative Results

Após digestão com tecido, o lançamento de folhas epiteliais e glândulas pode ser observado, como mostrado na figura 1A; Este é um controle positivo que indica que a digestão enzimática foi bem sucedida. O número de células viáveis totais e DCs recuperados por grama de tecido também é mostrado na figura 1B e Figura 1, respectivamente. As células imunes representam entre 5-30% das células…

Discussion

DCs da mucosa são uma população de células raras fortemente influenciada pelo ambiente de tecido, que muda seu fenótipo e a função, uma vez que eles entram os tecidos3. Enquanto o sangue derivado DCs são um modelo muito útil, totalmente não representam a diversidade de populações de DC, encontrado em tecidos. Portanto, para entender as características únicas do DCs da mucosa, o isolamento de células primárias de tecidos é necessário. Isolamento de DCs em locais anatômicos difere…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bolsas de estudo suportado pelo NIH, AI102838 e AI117739 (CRW). Agradecemos a Richard Rossoll para obter assistência técnica. Análise de fluxo cytometric foi realizado em DartLab, o recurso compartilhado no Dartmouthsupported por (P30CA023108-37) e (P30GM103415-15).

Materials

Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Hyclone SH30015.03
Penicillin-streptomycin Hyclone SV30010
HEPES (1M) Hyclone 15630-080
Collagenase IV Sigma C5138
Deoxyribonuclease I Worthington Biochemical LS002140
D-glucose Sigma Aldritch 50-99-7
0.22 um Stericup 500 mL  filter Millipore SCGPU05RE
100mm x 15mm polystyrene petri dish Fisherbrand FB0875712
150mm x 15mm polystyrene petri dish Fisherbrand FB0875714
150mm x 25mm polystyrene dish Corning 430599 Treated cell culture dish
Isotemp Incubator Fisher Scientific FICO3500TABB 5.0% CO2
American Rotator V American DADE R4140
250 um nylon mesh Sefar 03-250/50
20 um nylon mesh Sefar 03-20/14
Beckman GS-6R Centrifuge Beckman 358702
X-VIVO 15 with Gentamicin L-Gln, Phenol Red, 1 L Lonza 04-418Q
Human AB Serum Valley Biomedical HP1022
Histopaque-1077 Sigma Aldritch 10771
Phosphate Buffer Solution (PBS) National Diagnostics CL-253 pH 7.4
Dead Cell Removal Kit Miltenyi Biotec 130-090-101
Pre-separation filter (30um) Miltenyi Biotec 130-041-407
LS column Miltenyi Biotec 130-042-410
Quadro MACS Separator Miltenyi Biotec 130-090-976
MACS multi-stand Miltenyi Biotec 130-042-303
EDTA USB 15694
CD1a Microbeads, human Miltenyi Biotec 130-051-001
CD14 Microbeads, human Miltenyi Biotec 130-050-201
eFluor 670 cell proliferation dye eBiosciences 65-0840-85
96 well round bottom plate Falcon 9/8/2866
Zombie yellow viability dye Biolegend 423104
CD3 APC/Cy7, anti-human Tonbo Biosciences 25-0038-T100
CD4 PE, anti-human eBiosciences 12-0048-42
CD8a FITC, anti-human Tonbo Biosciences 35-0086-T100
Gallios Flow Cytometer Beckman Coulter Life Sciences B43618 10 color, VBR
MACSquant Analyzer 10 Miltenyi Biotec 130-096-343 8 color, VBR

References

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Cite This Article
Rodriguez-Garcia, M., Fortier, J. M., Barr, F. D., Wira, C. R. Isolation of Dendritic Cells from the Human Female Reproductive Tract for Phenotypical and Functional Studies. J. Vis. Exp. (133), e57100, doi:10.3791/57100 (2018).

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