Genetisk kode utvidelse fungerer som et kraftig verktøy for å studere en rekke biologiske prosesser, herunder protein acetylation. Her viser vi en lettvinte protokoll for å utnytte denne teknikken for å generere homogent acetylated proteiner ved bestemte områder i Escherichia coli celler.
Post-translasjonell endringer som oppstår på bestemte plasseringer av proteiner har vist å spille viktige roller i en rekke cellulære prosesser. Blant dem er reversibel lysin acetylation en av de mest distribuerte inne alle domenen av livet. Selv om flere masse massespektrometri-baserte acetylome studier er utført, ytterligere er karakteristikk av disse antatte acetylation mål begrenset. En mulig årsak er at det er vanskelig å generere rent acetylated proteiner på ønsket plassering ved de fleste klassiske biokjemiske tilnærminger. For å overvinne denne utfordringen, brukes genetiske koden ekspansjon teknikken for å bruke paret en utviklet pyrrolysyl-tRNA synthetase variant og dens beslektet tRNA fra Methanosarcinaceae arter, til direkte cotranslational inkorporering av acetyllysine i det bestemte området i protein av interesse. Etter første søknad i studiet av histone acetylation, har denne tilnærmingen tilrettelagt acetylation studier på en rekke proteiner. I dette arbeidet viste vi en lettvinte protokoll for å produsere site-specifically acetylated proteiner ved hjelp av modellen bakterien Escherichia coli som vert. Malate dehydrogenase ble brukt som en demonstrasjon eksempel i dette arbeidet.
Post-translasjonell endringer (PTMs) proteiner oppstår etter oversettelsesprosessen, og oppstår kovalente tillegg av funksjonelle grupper til aminosyre rester, spiller viktige roller i nesten alle biologiske prosesser, herunder genet transkripsjon, stressrespons, differensiering og metabolisme1,2,3. Hittil om 400 særegne vært PTMs identifisert4. Intrikate genomet og proteom forsterkes i stor grad av protein PTMs, som de regulerer protein aktivitet og lokalisering, og påvirker samspill med andre molekyler som proteiner, atomer syren, lipider og kofaktorer5.
Protein acetylation har vært i forkant av PTMs studier i de siste to tiårene6,7,8,9,10,11,12. Lysin acetylation ble først oppdaget i histones mer enn 50 år siden13,14, har blitt godt gransket, og er kjent i mer enn 80 transkripsjonsfaktorer, regulatorer og ulike proteiner15, 16,17. Studier på protein acetylation har ikke bare gitt oss en dypere forståelse av dens forskrifter mekanismer, men også veiledet behandlinger for en rekke sykdommer forårsaket av dysfunksjonelle acetylation18,19, 20 , 21 , 22 , 23. det ble antatt at lysin acetylation skjer bare i eukaryoter, men nyere studier har vist at protein acetylation spiller også nøkkelroller i bakteriell fysiologi, inkludert chemotaxis, acid motstand, aktivisering og stabilisering av virusets øyer og andre virulens relaterte proteiner24,25,26,27,28,29.
En vanlig metode å karakterisere biokjemisk lysin acetylation bruker nettstedet-rettet mutagenese. Glutamin er brukt som en etterligne av acetyllysine på grunn av sin liknende størrelse og polaritet. Arginine er brukt som en ikke-acetylated lysin etterligne, siden den opprettholder sitt positive ladningen under fysiologiske forhold, men kan ikke være acetylated. Men begge imiterer er ikke ekte isosteres og alltid gir ikke de forventede resultater30. Den strengeste tilnærmingen er å generere homogent acetylated proteiner på bestemte lysin rester, som er vanskelig eller umulig for mest klassiske metodene på grunn av den lave støkiometri av lysin acetylation i naturen7,11. Denne utfordringen har vært unraveled av den genetiske kode ekspansjon strategien, som sysselsetter en utviklet pyrrolysyl-tRNA synthetase variant fra Methanosarcinaceae Art å lade tRNAPyl med acetyllysine, utnytter verten translasjonsforskning maskiner å undertrykke UAG stoppe codon i mRNA og dirigerer inkorporering av acetyllysine i designet plasseringen av målet protein31. Vi har nylig optimalisert dette systemet med en forbedret EF-Tu-bindende tRNA32 og en oppgradert acetyllysyl-tRNA synthetase33. Videre har vi brukt dette forbedret innlemmelse systemet i acetylation studier malate dehydrogenase34 og tyrosyl-tRNA synthetase35. Her viser vi protokollen for å generere rent acetylated proteiner fra molekylær kloning til biokjemisk identifisering ved hjelp av malate dehydrogenase (MDH), som vi har mye studert som en demonstrativt eksempel.
Genetisk inkorporering av noncanonical aminosyrer (ncAAs) er basert på undertrykkelse av en tilordnet codon, hovedsakelig den oransje stopp codon UAG36,37,38,39, av ncAA-ladet tRNA som inneholder de tilsvarende anticodon. Som er kjent, UAG codon er anerkjent av det løslate faktor-1 (RF1) i bakterier, og det kan også være undertrykt nær beslektet tRNAs fra vertene av kanoniske aminosyrer (c…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av NIH (AI119813), oppstart fra University of Arkansas, og award fra Arkansas biovitenskap Instituttet.
Bradford protein assay | Bio-Rad | 5000006 | Protein concentration |
4x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610747 | SDS sample buffer |
Coomassie G-250 Stain | Bio-Rad | 1610786 | SDS-PAGE gel staining |
4-20% SDS-PAGE ready gel | Bio-Rad | 4561093 | Protein determination |
Ac-K-100 (HRP Conjugate) | Cell Signaling | 6952 | Antibody |
IPTG | CHEM-IMPEX | 194 | Expression inducer |
Nε-Acetyl-L-lysine | CHEM-IMPEX | 5364 | Noncanonical amino acid |
PD-10 desalting column | GE Healthcare | 17085101 | Desalting |
Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit | NEB | E0554 | Introducing the stop codon |
BL21 (DE3) cells | NEB | C2527 | Expressing strain |
QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27106 | Extracting plasmids |
Ni-NTA resin | QIAGEN | 30210 | Affinity purification resin |
nicotinamide | Sigma-Aldrich | N3376 | Deacetylase inhibitor |
β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | Reducing agent |
BugBuster Protein Extraction Reagent | Sigma-Aldrich | 70584 | Breaking cells |
Benzonase nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | DNase |
ECL Western Blotting Substrate | ThermoFisher | 32106 | Chemiluminescence |
Premixed LB Broth | VWR | 97064 | Cell growth medium |
Bovine serum albumin | VWR | 97061-416 | western blots blocking |