Summary

بروتوكول سهلة لتوليد بروتينات سيتيسبيسيفيكالي أسيتيلاتيد في الإشريكيّة القولونية

Published: December 09, 2017
doi:

Summary

التوسع في الشفرة الجينية بمثابة أداة قوية لدراسة طائفة واسعة من العمليات البيولوجية، بما في ذلك أسيتيليشن البروتين. هنا نظهر بروتوكول سهلة لاستغلال هذه التقنية لتوليد البلوتينيوم أسيتيلاتيد البروتينات في مواقع معينة في خلايا الإشريكيّة القولونية .

Abstract

بوستترانسلاشونال التعديلات التي تحدث في مواقع محددة من البروتينات قد ثبت أن تلعب أدواراً هامة في مجموعة متنوعة من العمليات الخلوية. فيما بينها، أسيتيليشن يسين عكسها واحد لتوزيعها على نطاق واسع في جميع مجالات الحياة. على الرغم من أن تم إجراء العديد من الدراسات أسيتيلومي الجماعي القائم على قياس الطيف الكتلي، كذلك وصف هذه الأهداف acetylation المفترضة كانت محدودة. أحد الأسباب المحتملة هو أن من الصعب لتوليد بروتينات أسيتيلاتيد بحتة في المواقف المطلوبة بمعظم النهج البيوكيميائية الكلاسيكية. للتغلب على هذا التحدي، تم تطبيق تقنية توسيع الشفرة الجينية لاستخدام الزوج من متغير سينثاتيز المهندسة بيروليسيل-الحمض الريبي النووي النقال، والمشابهة لها الحمض الريبي النووي النقال من أنواع ميثانوسارسيناسيي ، وتوجيه إدماج كوترانسلاشونال من أسيتيليسيني في موقع محدد في بروتين الفائدة. بعد التطبيق الأول في الدراسة من acetylation هستون، سهلت هذا النهج acetylation دراسات بشأن مجموعة متنوعة من البروتينات. في هذا العمل، أثبتنا بروتوكول السطحية لإنتاج البروتينات سيتيسبيسيفيكالي أسيتيلاتيد باستخدام نموذج بكتيريا الإشريكيّة القولونية كالمضيف. مالات نازعة كمثال مظاهرة في هذا العمل.

Introduction

تعديلات بوستترانسلاشونال (بتمس) من البروتينات التي تحدث بعد عملية الترجمة، وتنشأ عن إضافة المجموعات الوظيفية التساهمية لمخلفات الأحماض الأمينية، تضطلع بأدوار هامة في تقريبا جميع العمليات البيولوجية، بما في ذلك الجينات النسخ واستجابة الإجهاد والتمايز الخلوي والتمثيل الغذائي1،،من23. وحتى الآن، حوالي 400 مميزة قد بتمس المحددة4. المعضلة من الجينوم والبروتين يتم تضخيمه إلى حد كبير من قبل بتمس البروتين، كما أنها تنظم نشاط البروتين والتعريب، وتؤثر على التفاعل مع جزيئات أخرى مثل البروتينات والأحماض النووية والدهون والعوامل المساعدة5.

وقد أسيتيليشن البروتين في طليعة الدراسات بتمس في آخر عقدين6،،من78،9،10،11،12. أسيتيليشن يسين كان أول من اكتشف في هيستونيس منذ أكثر من 50 عاماً13،14، قد تم التدقيق جيدا، ومن المعروف أن توجد في أكثر من 80 من عوامل النسخ، والمنظمين، ومختلف البروتينات15، ،من 1617. دراسات في أسيتيليشن البروتين قد وفر لنا فهما أعمق لآلياتها التنظيمية، بل يسترشد أيضا علاجات لعدد من الأمراض الناجمة عن اختلال أسيتيليشن18،19، 20 , 21 , 22 , 23-وكان يعتقد أن acetylation يسين يحدث فقط في حقيقيات النوى، ولكن الدراسات التي أجريت مؤخرا أظهرت أن acetylation البروتين كما تلعب أدواراً رئيسية في فسيولوجيا البكتيريا، بما في ذلك إنزيمية ومقاومة الأحماض والتنشيط وتحقيق الاستقرار في جزر الإمراضية وضراوة الأخرى المتعلقة بالبروتينات24،25،،من2627،،من2829.

باستخدام طريقة شائعة المتحلل تميز acetylation يسين الطفرات الموجهة من الموقع. الجلوتامين كتقليد أسيتيليسيني بسبب حجمها وقطبية مماثلة. ويستخدم ارجينين كتقليد يسين غير أسيتيلاتيد، نظراً لأنه يحتفظ تهمة إيجابية في ظل الظروف الفسيولوجية ولكن لا يمكن أن يكون أسيتيلاتيد. ومع ذلك، كلا يقلد ليست إيسوستيريس حقيقية ولا تسفر دائماً عن النتائج المتوقعة30. النهج الأكثر صرامة لتوليد بروتينات أسيتيلاتيد البلوتينيوم في المخلفات يسين محددة، التي من الصعب أو المستحيل على الأساليب الأكثر كلاسيكية بسبب ستويتشيوميتري منخفض من acetylation يسين في الطبيعة7،11. وقد تم متدهور هذا التحدي في استراتيجية التوسع في الشفرة الجينية، التي توظف هندسة بيروليسيل-الحمض الريبي النووي النقال سينثاتيز البديل من الأنواع ميثانوسارسيناسيي لشحن الحمض الريبي النووي النقالبرونتوسوروس مع أسيتيليسيني، يستخدم المضيف الآلات متعدية لقمع الفريق الاستشاري وقف كودون في مرناً، ويوجه إدماج أسيتيليسيني في موقف مصممة ل البروتين المستهدف31. في الآونة الأخيرة، ونحن الأمثل هذا النظام مع الإنكليزية والفرنسية-تو-ملزمة الحمض الريبي النووي النقال تحسين32 ورفع مستوى أسيتيليسيل-الحمض الريبي النووي النقال سينثاتيز33. وعلاوة على ذلك، نحن طبقت هذا النظام إدماج تعزيز الدراسات acetylation مالات نازعة34 وتيروسيل-الحمض الريبي النووي النقال سينثاتيز35. هنا، علينا أن نظهر البروتوكول من أجل توليد بروتينات أسيتيلاتيد بحتة من الاستنساخ الجزيئي لتحديد الهوية الكيميائية الحيوية باستخدام نازعة مالات (MDH)، الذي درسناه على نطاق واسع كمثال تتضح.

Protocol

1-موقع الموجه الطفرات الجينات المستهدفة ملاحظة: يتم التعبير عن MDH تحت T7 المروج في ناقل ثنائي بنزوفيوران متعدد الكلور-1 مع مصدر CloDF13 وعدد نسخة من 20 إلى 4034. إدخال كودون وقف العنبر في موقف 140 في الجينات بالاشعال (الأمام التمهيدي: جتجتتاتجاكعلامة</str…

Representative Results

عائد البروتين MDH أسيتيلاتيد كان 15 ملغ في الثقافة 1 لتر، بينما من البرية من نوع MDH 31 ملغ في الثقافة 1 لتر. تم تحليل البروتينات المنقاة من الحزب الديمقراطي الصربي صفحة كما هو مبين في الشكل 1. MDH البرية من نوع كمراقبة إيجابية34. البروتين تنقيته من الخ?…

Discussion

ويستند إدراج الوراثية للأحماض الأمينية نونكانونيكال (ncAAs) قمع كودون المعينة، معظمهم إيقاف العنبر كودون الفريق الاستشاري36،37،38،39، بالحمض الريبي النووي النقال المشحون نكا تحتوي على أنتيكودون المقابلة. وكما هو معروف، كو…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل المعاهد الوطنية للصحة (AI119813)، البدء من جامعة اركنساس، والجائزة من معهد العلوم البيولوجية ولاية أركنسو.

Materials

Bradford protein assay Bio-Rad 5000006 Protein concentration
4x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 1610747 SDS sample buffer
Coomassie G-250 Stain Bio-Rad 1610786 SDS-PAGE gel staining
4-20% SDS-PAGE ready gel Bio-Rad 4561093 Protein determination
Ac-K-100 (HRP Conjugate) Cell Signaling 6952 Antibody
IPTG CHEM-IMPEX 194 Expression inducer
Nε-Acetyl-L-lysine CHEM-IMPEX 5364 Noncanonical amino acid
PD-10 desalting column GE Healthcare 17085101 Desalting
Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit NEB E0554 Introducing the stop codon
BL21 (DE3) cells NEB C2527 Expressing strain
QIAprep Spin Miniprep Kit QIAGEN 27106 Extracting plasmids
Ni-NTA resin QIAGEN 30210 Affinity purification resin
nicotinamide Sigma-Aldrich N3376 Deacetylase inhibitor
β-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250 Reducing agent
BugBuster Protein Extraction Reagent Sigma-Aldrich 70584 Breaking cells
Benzonase nuclease Sigma-Aldrich E1014 DNase
ECL Western Blotting Substrate ThermoFisher 32106 Chemiluminescence
Premixed LB Broth VWR 97064 Cell growth medium
Bovine serum albumin VWR 97061-416 western blots blocking

References

  1. Krishna, R. G., Wold, F. Post-translational modification of proteins. Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol. 67, 265-298 (1993).
  2. Lothrop, A. P., Torres, M. P., Fuchs, S. M. Deciphering post-translational modification codes. FEBS Lett. 587 (8), 1247-1257 (2013).
  3. Walsh, C. T. . Posttranslational modification of proteins : expanding nature’s inventory. , (2006).
  4. Khoury, G. A., Baliban, R. C., Floudas, C. A. Proteome-wide post-translational modification statistics: frequency analysis and curation of the swiss-prot database. Sci Rep. 1, (2011).
  5. Grotenbreg, G., Ploegh, H. Chemical biology: dressed-up proteins. Nature. 446 (7139), 993-995 (2007).
  6. Arif, M., Selvi, B. R., Kundu, T. K. Lysine acetylation: the tale of a modification from transcription regulation to metabolism. Chembiochem. 11 (11), 1501-1504 (2010).
  7. Cohen, T., Yao, T. P. AcK-knowledge reversible acetylation. Science’s STKE : signal transduction knowledge environment. (245), pe42 (2004).
  8. Drazic, A., Myklebust, L. M., Ree, R., Arnesen, T. The world of protein acetylation. Biochim Biophys Acta. 1864 (10), 1372-1401 (2016).
  9. Escalante-Semerena, J. C. Nε-acetylation control conserved in all three life domains. Microbe. 5, 340-344 (2010).
  10. Kouzarides, T. Acetylation: a regulatory modification to rival phosphorylation?. The EMBO journal. 19 (6), 1176-1179 (2000).
  11. Soppa, J. Protein acetylation in archaea, bacteria, and eukaryotes. Archaea. , (2010).
  12. Verdin, E., Ott, M. 50 years of protein acetylation: from gene regulation to epigenetics, metabolism and beyond. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (4), 258-264 (2015).
  13. Allfrey, V. G., Faulkner, R., Mirsky, A. E. Acetylation and Methylation of Histones and Their Possible Role in the Regulation of Rna Synthesis. P Natl Acad Sci USA. 51, 786-794 (1964).
  14. Phillips, D. M. The presence of acetyl groups of histones. Biochem j. 87, 258-263 (1963).
  15. Sterner, D. E., Berger, S. L. Acetylation of histones and transcription-related factors. Microbiology and molecular biology reviews: MMBR. 64 (2), 435-459 (2000).
  16. Glozak, M. A., Sengupta, N., Zhang, X., Seto, E. Acetylation and deacetylation of non-histone proteins. Gene. 363, 15-23 (2005).
  17. Close, P., et al. The emerging role of lysine acetylation of non-nuclear proteins. Cell Mol Life Sci. 67 (8), 1255-1264 (2010).
  18. Iyer, A., Fairlie, D. P., Brown, L. Lysine acetylation in obesity, diabetes and metabolic disease. Immunol Cell Biol. 90 (1), 39-46 (2012).
  19. You, L., Nie, J., Sun, W. J., Zheng, Z. Q., Yang, X. J. Lysine acetylation: enzymes, bromodomains and links to different diseases. Essays Biochem. 52, 1-12 (2012).
  20. Bonnaud, E. M., Suberbielle, E., Malnou, C. E. Histone acetylation in neuronal (dys)function. Biomol Concepts. 7 (2), 103-116 (2016).
  21. Fukushima, A., Lopaschuk, G. D. Acetylation control of cardiac fatty acid beta-oxidation and energy metabolism in obesity, diabetes, and heart failure. Biochim Biophys Acta. 1862 (12), 2211-2220 (2016).
  22. Kaypee, S., et al. Aberrant lysine acetylation in tumorigenesis: Implications in the development of therapeutics. Pharmacol Ther. 162, 98-119 (2016).
  23. Tapias, A., Wang, Z. Q. Lysine Acetylation and Deacetylation in Brain Development and Neuropathies. Genomics Proteomics Bioinformatics. 15 (1), 19-36 (2017).
  24. Hu, L. I., Lima, B. P., Wolfe, A. J. Bacterial protein acetylation: the dawning of a new age. Molecular microbiology. 77 (1), 15-21 (2010).
  25. Jones, J. D., O’Connor, C. D. Protein acetylation in prokaryotes. Proteomics. 11 (15), 3012-3022 (2011).
  26. Bernal, V., et al. Regulation of bacterial physiology by lysine acetylation of proteins. New biotechnol. 31 (6), 586-595 (2014).
  27. Hentchel, K. L., Escalante-Semerena, J. C. Acylation of Biomolecules in Prokaryotes: a Widespread Strategy for the Control of Biological Function and Metabolic Stress. Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 79 (3), 321-346 (2015).
  28. Ouidir, T., Kentache, T., Hardouin, J. Protein lysine acetylation in bacteria: Current state of the art. Proteomics. 16 (2), 301-309 (2016).
  29. Wolfe, A. J. Bacterial protein acetylation: new discoveries unanswered questions. Curr Genet. 62 (2), 335-341 (2016).
  30. Albaugh, B. N., Arnold, K. M., Lee, S., Denu, J. M. Autoacetylation of the histone acetyltransferase Rtt109. J Biol Chem. 286 (28), 24694-24701 (2011).
  31. Neumann, H., Peak-Chew, S. Y., Chin, J. W. Genetically encoding Nε-acetyllysine in recombinant proteins. Nat chem biol. 4 (4), 232-234 (2008).
  32. Fan, C., Xiong, H., Reynolds, N. M., Soll, D. Rationally evolving tRNAPyl for efficient incorporation of noncanonical amino acids. Nucleic Acids Res. 43 (22), e156 (2015).
  33. Bryson, D., et al. Continuous directed evolution of aminoacyl-tRNA synthetases to alter amino acid specificity and enhance activity. Nat Chem Biol. , (2017).
  34. Venkat, S., Gregory, C., Sturges, J., Gan, Q., Fan, C. Studying the Lysine Acetylation of Malate Dehydrogenase. J Mol Biol. 429 (9), 1396-1405 (2017).
  35. Venkat, S., Gregory, C., Gan, Q., Fan, C. Biochemical characterization of the lysine acetylation of tyrosyl-tRNA synthetase in Escherichia coli. Chembiochem. 18 (19), 1928-1934 (2017).
  36. Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding new chemistries to the genetic code. Annu Rev Biochem. 79, 413-444 (2010).
  37. Mukai, T., Lajoie, M. J., Englert, M., Soll, D. Rewriting the Genetic Code. Annu Rev Microbiol. , (2017).
  38. O’Donoghue, P., Ling, J., Wang, Y. S., Soll, D. Upgrading protein synthesis for synthetic biology. Nat Chem Biol. 9 (10), 594-598 (2013).
  39. Chin, J. W. Expanding and reprogramming the genetic code of cells and animals. Annu Rev Biochem. 83, 379-408 (2014).
  40. O’Donoghue, P., et al. Near-cognate suppression of amber, opal and quadruplet codons competes with aminoacyl-tRNAPyl for genetic code expansion. FEBS Lett. 586 (21), 3931-3937 (2012).
  41. Aerni, H. R., Shifman, M. A., Rogulina, S., O’Donoghue, P., Rinehart, J. Revealing the amino acid composition of proteins within an expanded genetic code. Nucleic Acids Res. 43 (2), e8 (2015).
  42. Huang, Y., et al. A convenient method for genetic incorporation of multiple noncanonical amino acids into one protein in Escherichia coli. Mol Biosyst. 6 (4), 683-686 (2010).
  43. Venkat, S., et al. Genetically encoding thioacetyl-lysine as a nondeacetylatable analog of lysine acetylation in Escherichia coli. FEBS Open. , (2017).
  44. Wan, W., Tharp, J. M., Liu, W. R. Pyrrolysyl-tRNA synthetase: an ordinary enzyme but an outstanding genetic code expansion tool. Biochim Biophys Acta. 1844 (6), 1059-1070 (2014).
  45. Gregoretti, I. V., Lee, Y. M., Goodson, H. V. Molecular evolution of the histone deacetylase family: functional implications of phylogenetic analysis. J Mol Biol. 338 (1), 17-31 (2004).
  46. Weinert, B. T., et al. Acetyl-phosphate is a critical determinant of lysine acetylation in E. coli. Mol cell. 51 (2), 265-272 (2013).

Play Video

Cite This Article
Venkat, S., Gregory, C., Meng, K., Gan, Q., Fan, C. A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli. J. Vis. Exp. (130), e57061, doi:10.3791/57061 (2017).

View Video