精製マウス肝類洞内皮細胞と肝細胞の灌流

このプロトコルに記載されている動物のすべての手続きは、機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) 議定書 #1435 ネブラスカ州 – リンカーンの大学によって承認されています。 1. 準備 溶液及び培地の調製 すべての培地と材料表によるとバッファーを準備します。 機器の準備 水浴を設定 (> 10 L) 42 ° C、可変的な速度、フラスコを保持するためのクランプと蠕動性ポンプで。曲線はさみと鉗子 (図 1) を準備します。 上または水のお風呂に隣接するベーキング シート (約 38 × 26 cm) 発泡スチロール パッド (50 mL コニカル ラック) で 20 × 20 cm の部分 (図 1) にカット吸収 underpad かぶせてを設定します。 近くにマスキング テープ (5-8 cm) の一部を配置します。つまりカットと使用する準備ができて近くに 20 cm ポリエステル ミシン糸を配置します。引き込み式の針 (7 mm × 19 mm、図 1) プラスチック製カテーテルを取得します。 ガラス製品の準備 クランプを使用して、配置、200 mL の 1x PBS ソリューションに 2 つの 1 mL ピペットにはストッパー付きを含む水のお風呂で 1 L フラスコを固定します。ゴム コルクは閉回路で流体の循環を許可するノッチです。 別のクランプと液体液体上に残ります、フラスコに酸素を吹き込み吹フラスコの底の近くで 1 つは 2 つの 1 mL ピペットにはストッパーとバッファー 2 45 mL を含む 125 mL フラスコを配置します。メモ: ストッパーで各ピペットには管の容易な切換えのために最後に接続されているアダプターを切断クイックがあります。酸素は、液体に浸漬しないストッパーにピペットで両方のフラスコに穏やかに流れるでしょう。 2 滅菌結晶皿置いておきます。 2. 動物のプロシージャ 風呂の水で 42 ° C に PBS バッファー 2 ソリューションをウォーム アップし、液体のラインを暖かい保つために閉鎖回路でチューブの少なくとも 20 mL/分のため PBS を循環します。ままに風呂の水で余分なチューブを浸す 42 ° c. にできるだけ近い1 L フラスコ含む PBS にチューブのオス側をドレインします。 吸収 underpad にコットン ボールを配置し、綿球で転送ピペットを使用して 30% イソフルラン (ポリエチレング リコール 200 イソフルランの蒸発速度を減少させる製) 約 2 mL を追加します。 尻尾をマウスを拾う、結晶の料理の一つに、マウスがある麻酔を吸入するための小さなスペースを持つよう迅速に綿球に皿を覆します。マウスの呼吸数を観察し、マウスが効果的に麻酔します。注: 呼吸の速さは遅く、深いをする必要があります尾弛緩と足を麻酔下でピンチ テストに反応しません。IACUC ガイドライン詳細についてを参照してください。 (これは 1 〜 2 分かかる) 麻酔下マウスが起こって、プランジャーを抜くと、小さな綿のボールを挿入することによってバレルの 10 mL の注射器を準備します。バレルの内部の綿ボールに転送ピペットで 30% イソフルランの 1-2 mL を追加し、無意識にマウスを待っている間、テーブルの上をオープン エンド型バレルを配置します。 すぐに結晶皿を脱いで、背中にマウスを反転し、その鼻をシリンジ バレルを配置します。ダブル チェック呼吸率、つま先のピンチと弛緩な尾。つま先のピンチと弛緩の尾への応答は、マウスは完全に麻酔下でないことを示します。シリンジ バレルを保つ意識を維持するために鼻の上。 仰臥位で伸ばした肢を持つマウスの足を通して場所親指の鋲。腹部および 70% イソプロパノール、エタノールと胸郭に濡れています。 1 つの手でストレートの鉗子で腹部の基部付近の皮膚を持ち上げます。もう一方の手ではさみ、テント皮膚や腹膜にカットします。切開は、水平またはテントの肌のベースにする必要があります。必ず腸へのアクセスを得るために皮膚や腹膜のすべての層をカットしてください。横方向の周りカット胸郭まで腹部両側に刻み目をつける人の臓器のいずれかなし。 下部胸郭間切断することによって皮膚のフラップをカットします。門脈を公開する鉗子の背で腸を右に移動します。注: 動物から出血も最小限。動物を呼吸する必要がありますまだ、深い麻酔下。 上膵十二指腸静脈 (図 3の矢印) と肝臓の間の門脈の下に閉じたカーブタイプ鉗子を配置します。 門脈、下に鉗子を開きます。スレッドをつかんで門脈下中心になるので、慎重に引き出します。門脈周囲オーバーハンド ノットを結ぶダウン cinching なし。 門脈下カーブタイプ鉗子を置き、静脈 (図 4A) をまっすぐにマウスの尻尾に向かって静かに引き出します。 もう一方の手でカテーテル、顔アップと門脈鉗子 (図 4B) 近くの下の部分と平行針の傾斜面を配置します。 そっと針 (図 4C) で静脈を穿刺します。針の傾斜面は、静脈の内腔を確認します。バネ付きの針を撤回、ベベルは静脈の分岐エリア近くまで静脈を通して高分子カテーテルをプッシュし続けます。これは肝臓内です。カテーテルを正しく配置すると、血液の逆流が表示されます。(図 4D)。 オーバーハンド ノットを締め、それを安定させるためにカテーテルにプルダウンします。20 mL/min から 4 mL/分のポンプ率を下げて排水のため別の主要な血管を切りすぐに。最適な結果を得るのための腹部大動脈をカットします。 カテーテル (図 5A) のメス側に管のオス側を配置します。ラインに気泡がないことを確認します。カテーテルがプッシュに肝臓や静脈のうちのいずれかではないことに注意してください。静脈からの逆流を防ぐのに役立ちます (図 5B、C) の正しい位置にカテーテルを保つことができますが、スレッドの配置は必須ではありません。 マスキング テープを使用、underpad にチューブを固定します。肝臓、数回を膨らませるため排水の血管を圧迫するストレートの鉗子を使用してすべての血が (図 5D) を排水していることを確認します。注: 標準研究室テープが働かないかもしれない;ただし、マスキング テープは、ウェットコンディションでも、underpad につっこまれたままでしょう。 3. 肝灌流 肝臓は、PBS のフラッシュは中、IV 型コラゲナーゼの約 24 mg を測定し、風呂の水でバッファー 2 45 mL を含むフラスコ内に配置。必ず、コラゲナーゼが完全に解散したとき、フラスコの液体を旋回し、クランプに戻ってフラスコを置いて、フラスコの液体コンテナー部分が完全に水に沈めてください。 PBS のフラッシュは肝臓の色の変化を観察します。125 mL のフラスコに 1 L フラスコから流出管を変更します。肝臓に流入する空気の泡ができないようにします。 灌流のバッファーでは、肝臓に達すると、容器内のいくつかの圧力を構築でき、肝臓のすべての葉をいっぱいにこの液体廃液血管絞るタイトな簡潔に。肝臓 (グリソン) を取り巻く薄い結合組織をバーストし、灌流肝臓の毛細血管内の液体の流れを破壊する可能性があります、長すぎると、排水を遮断しないようにします。 組織を通じて流れてきたすべての 45 mL まで、肝臓を灌流するコラゲナーゼとバッファー 2 を許可します。注: 成功した場合、グリソン鞘の区切る必要があります肝臓や肝組織、柔組織から非晶質自体表示 必要があります。 他の結晶皿にバッファー 1 の約 10 mL を追加し、マウスの隣に配置します。 カテーテルを外し、ポンプをオフにします。 ストレート ピンセットとはさみ、マウスから肝臓をカットします。コラゲナーゼの消化力は非常に効率的なされた場合マウスから肝臓をスクープし、バッファー 1 に配置する一方、滅菌スプーンを持っている必要があります。 4. 肝細胞浄化 注: セルの操作は、セルのすべての以降の手順で培養する場合、汚染を制限する滅菌のティッシュ文化フードで実行されます。 生殖不能の技術を使用して、肝臓をピンセットでつかむし、肝臓から細胞を軽く振る。引き裂くまたはグリソンを引き戻す: 細胞が肝臓から揺さぶられると、バッファーは不透明になります。 一番上を越えて 100 μ m フィルターで 50 mL の円錐形に細胞液を注ぐ。 肝の残党により多くのバッファー 1 を追加し、続ける細胞を横に振る。とき肝臓の未消化の部分に譲歩しないもうセルまたはセルを欠いている肝臓が表示されるまで続行します。 別の 50 mL を 40 μ m のフィルターを含む円錐形に細胞の液体を注ぐ。 円錐スイング バケツ ローター 100 x g で 3 分間遠心します。注: これは細胞ペレットを取り除くことが、最大のブレーキを使用しないでください。4 ° C でのすべての残りの遠心分離手順にとっては十分な 80% でブレーキを使用します。 きれいな円錐形に (Npc と死んだ肝細胞を含む) の上澄みを離れて注ぎ、氷の上に置きます。これはペレットの付着を観察する 1 つの動きでを確認します。 バッファー 1 の 40 mL にペレットを再懸濁します。4.5 および 4.6 手順を繰り返します。バッファー 3 40 mL にペレットを再懸濁します。4.5 および 4.6 の手順を 2 回繰り返します。 暖かい DMEM + 10 で精製した肝細胞を再懸濁します s + 2 x のペニシリン-ストレプトマイシン (ペン/連鎖球菌)。 細胞がコラーゲンをコーティングしたプレート上で培養した、1 h の従うことができ、交換メディアを少なくとも一度これとして任意の初期の細菌汚染を防ぐが。 0.05% コラーゲン 0.001% 酢酸 37 ° C で少なくとも 1 時間のためにそれらをインキュベートし、1 × PBS で洗浄し、コラーゲンをコーティングしたプレートを作る。 場合は肝細胞生存率は低く、精製高実行可能な肝細胞を取得し、適応 Kreamerら10から次のプロトコルを使用する欲求があります。 PVP 溶液 (パーコール、水の 23%/w ソリューションおよび 15-30 nm コロイド状シリカ粒子密度遠心分離にポリビニルピロリドンでコーティング) のミックス 9 ボリュームと iso 浸透の PVP ソリューション (SIP) にするための 10 の x HBSS の 1 つのボリューム。 SIP の 24 mL を滅菌 50 mL コニカル 4 ° C で最大 2 ヶ月間これらの条件で保存可能性がありますに追加します。 5-10 × 106セル/ml 培 4.8 の手順に記載されている 1 つのように肝細胞濃度を調整します。 各 24 mL の円錐形を含む SIP に細胞懸濁液 25 mL を加え、穏やかな逆転によって混ぜます。このソリューションの密度は 1.06 g/mL です。 4 ° C で 10 分間 50 x g で円錐形遠心します。 SIP および凝集剤、吸引し、HBSS で細胞を再懸濁します。 4 ° C で 10 分間 50 × g で遠心分離によって細胞を洗浄します。 4.10.6 の手順をもう一度繰り返すし、培地に細胞を再懸濁します。 5 秒の浄化 チューブから清 163 x g で 10 分間破棄でチューブを回すことによってステップ 4.6 から上清中に細胞をペレットし RPMI の 5 mL の血清なしですべて細胞ペレットの再懸濁します、1 つの管でそれらを一緒に分かち合います。 一度、すべてのペレットはプールされている、35 mL の最終巻に RPMI を追加します。 遠心分離機のプールされた 3 分慎重に吸引 RPMI のトップ 25 mL 25 mL ピペットと場所で氷の円錐形クリーン 50 mL で Npc を含むこのメディアの 25 x g で円錐形。 新鮮な RPMI 25 mL をチューブに追加し、ペレットを再懸濁します。 ステップ 5.3 第 2 洗浄、プール上清に対して繰り返します。メディアとペレット (ペレットは死んだ肝細胞のほとんどで構成されています) の 10 mL の残りを破棄します。10 分間 163 x g でプールされた上澄みを遠心します。 、遠心分離中に 50 mL の円錐形の PVP ソリューション グラデーションを準備します。 Percoll はかぶせて射出速度をできるだけ遅く設定 pipettor 25 mL に続いて 50 %pvp 溶液を 50 mL の円錐形の 15 mL を追加します。必ずこれは秒と株式会社ケーシーエスは、遠心分離後集計されます 2 つのレイヤーを設定する 15 mL マークで屈折線を観察してください。 PVP ソリューション グラデーションにそれらをオーバーレイやセル以前冷たい RPMI ステップ 5.5 の 10 mL にペレットを再懸濁します。必ず 2 つの層の間に明確な分界を維持してください。50% で設定のブレーキを 20 分間 805 x g でグラデーションを遠心します。 チューブに 20 ミリリットルのマークを上下方向から吸引し、この素材を破棄します。5 mL 転送ピペットと秒と 25/50% インターフェイスにある KCs を収集します。死んだ肝細胞は、これらのセルのいずれかの茶色の塊を破棄します。 円錐 50 mL にセルを配置し、PVP 溶液を希釈する 50 mL マークまで RPMI を追加します。80% のブレーキを 10 分間、200 × g で遠心分離機します。 吸引し上澄みを廃棄し、暖かい RPMI 12 mL の円錐形のコーンを洗いながらペレットを再懸濁します。 株式会社ケーシーエスからポリスチレン シャーレで培養上清を配置することによって、秒を分離し、室温で 8 分加湿培養孵卵器で孵化させなさい。 プレートに準拠して、株式会社ケーシーエスながら残りの秒を収集する最低速度設定 pipettor で、同じメディアでプレート 25 mL ピペットとリンスでメディアを吸い出しなさい。 10 分間 200 x g で秒を遠心し、FBS + ペン/連鎖球菌 RPMI + 5% で再懸濁します。価、細胞とコラーゲン被覆培養皿の場所。