Purificação de hepatócitos e células endoteliais sinusoidais de fígado de rato perfusão

Todos os animais procedimentos descritos no presente protocolo foram aprovados pelo Comitê de uso (IACUC) na Universidade de Lincoln – Nebraska sob protocolo #1435 e institucional Cuidado Animal. 1. preparação Preparação de soluções e meios de cultura Preparem-se todos os meios de cultura e reserva de acordo com a Tabela de materiais. Preparação dos instrumentos Configurar um banho de água (> 10 L) no 42 ° C, uma bomba peristáltica com velocidade variável e grampos para segurar os balões. Prepare-se curvas de tesoura e pinça (Figura 1). Na ou adjacente para o banho de água, configurar uma folha de cozimento (cerca de 38 x 26 cm) com um bloco de isopor (rack cónico de 50 mL), revestida com um absorvente underpad cortar um pedaço de 20 x 20 cm (Figura 1). Coloque um pedaço de fita crepe (5-8 cm) nas proximidades. Coloque um fio de poliéster de costura 20cm nas proximidades, ou seja, corte e pronto para usar. Obter um cateter plástico com uma agulha retrátil (7 mm x 19 mm, Figura 1). Preparação de material de vidro Usando grampos, coloque e imobilizar um frasco de 1L no banho de água contendo 200 mL de 1X PBS com uma rolha que tem duas pipetas de 1 mL para a solução. A rolha de borracha é entalhada para permitir a recirculação de fluido em circuito fechado. Com pinça, coloque um balão de 125 mL contendo 45 mL de tampão 2 junto com uma rolha que tem duas pipetas de 1 mL, um dos quais é no líquido perto do fundo do balão e o outro que fica acima do líquido e sopra oxigênio para o balão.Nota: Cada pipeta nas rolhas terá um rápido desconectar o adaptador conectado à extremidade para fácil troca da tubulação. Oxigênio vai estar fluindo suavemente os dois balões através da pipeta no batoque que não está imersa no líquido. Reserve dois pratos de cristalização estéril. 2. procedimento animal Aquecer as soluções de PBS e Buffer de 2 a 42 ° C em banho-maria e circular PBS pelo menos 20 mL/min em tubulação em circuito fechado para manter as linhas de líquido quente. Mergulhe qualquer excesso tubagem em banho-maria para permanecer tão próximo quanto possível de 42 ° C. Escorra a extremidade macho do tubo para o balão de 1L contendo PBS. Coloque uma bola de algodão sobre o absorvente underpad e adicionar cerca de 2 mL de 30% de isoflurano (composto em polietilenoglicol 200 que diminui a taxa de evaporação de isoflurano) sobre a bola de algodão com uma pipeta de transferência. Pegar o mouse pela cauda, coloque-o em um dos pratos cristalização e então rapidamente derrubar o prato para a bola de algodão para que o mouse tem um espaço pequeno inalar a anestesia. Observar a taxa de respiração do rato e certifique-se que o mouse é efetivamente sob anestesia.Nota: A taxa de respiração deve ser mais lento e mais profundo, a cauda flácida e as patas não responde para o teste do beliscão sob anestesia; consulte IACUC diretrizes para obter detalhes adicionais. Enquanto o mouse está indo sob anestesia (isto leva 1-2 min), prepare o cano de uma seringa de 10 mL, puxando o êmbolo e inserindo uma bola pequena de algodão. Adicionar 1-2ml de 30% de isoflurano com uma pipeta de transferência para a bola de algodão dentro do barril e coloque o barril encurvada para baixo sobre uma mesa, enquanto aguarda o mouse para se tornar inconsciente. Rapidamente, tire o prato de cristalização, vira o mouse de costas e coloque o barril da seringa sobre seu nariz. Verifique a taxa de respiração, pitada de dedo do pé e cauda flácida. Todas as respostas para a pitada do dedo do pé e cauda flácida indica que o mouse não é totalmente sob anestesia. Mantenha o cilindro da seringa sobre o focinho para manter a inconsciência. Lugar de aderências de polegar através as patas do rato, com os membros estendidos em posição supina. Molhe o abdômen e tórax com isopropanol 70% ou etanol. Com a pinça reta em uma mão, levante a pele perto da base do abdome. Com uma tesoura na outra mão, corte a pele tenda e peritônio. A incisão deve ser horizontal ou através da base da pele tenda. Não se esqueça de cortar todas as camadas da pele e do peritoneu para obter acesso ao intestino. Corte lateralmente em torno do abdômen até o tórax em ambos os lados sem roubar qualquer um dos órgãos. Corte o retalho de pele por corte em toda a caixa torácica inferior. Mova os intestinos para a direita, com as costas da pinça para expor a veia porta.Nota: Sangramento do animal deve ser mínima; o animal deve estar respirando e sob anestesia profunda. Coloque a pinça curva fechada debaixo da veia portal entre o fígado e a veia pancreaticoduodenal superior (seta daFigura 3 ). Abra a pinça enquanto debaixo da veia portal. Segure o thread e cuidadosamente, puxe-o através de modo que está centrado por baixo da veia portal. Amarre um nó de laçada ao redor da veia portal sem cinching-lo para baixo. Coloque a pinça curva sob a veia porta e puxe suavemente para o rabo do rato para endireitar a veia(Figura 4). Com o cateter na outra mão, coloque o bisel da agulha voltado para cima e paralela com a parte inferior da veia portal perto a pinça (Figura 4B). Suavemente, punção da veia com a agulha (Figura 4C). Certifique-se de que bisel da agulha é no lúmen da veia. Retirar a agulha com mola e continuam a empurrar o cateter de polímero através da veia até que o bisel é perto da área ramificada venosa. Isso é dentro do fígado. Se o cateter está colocado corretamente, um refluxo de sangue será visível. (Figura 4D). Aperte o nó de laçada e puxe-o para baixo do cateter para ajudar a estabilizá-lo. Imediatamente abaixar a taxa de bomba de 20 mL/min para 4 mL/min e cortar outro grande vaso sanguíneo para drenagem. Corte a aorta abdominalis para resultados óptimos. Coloque a extremidade macho do tubo para a final feminina do cateter (Figura 5A). Certifique-se de que não há nenhuma bolha de ar na linha. Cuidado que o cateter também não é empurrado para o fígado ou para fora da veia. Colocação do segmento não é essencial, embora ajuda a prevenir o refluxo da veia e ajuda a manter o cateter na posição correta (Figura 5B, C). Use fita adesiva para imobilizar os tubos no underpad. Use a pinça reta para espremer o vaso sanguíneo efluente para inflar o fígado algumas vezes para garantir que todo o sangue foi drenado para fora (Figura 5-D).Nota: Fita de laboratório padrão pode não funcionar; no entanto, a fita adesiva permanecerá furada para o underpad, mesmo em condições úmidas. 3. fígado perfusão Enquanto o fígado é lavagem com PBS, meça cerca de 24 mg de colagenase tipo IV e colocá-lo no frasco contendo 45 mL de tampão 2 em banho-maria. Não se esqueça de agitar o líquido no frasco para que a colagenase é totalmente dissolvido e colocar o balão volta a braçadeira para que a parte líquida contendo do balão é totalmente submerso na água. Observe a mudança na cor do fígado, como ele é liberado com PBS. Altere a tubagem de saída de balão de 1L no balão de 125 mL. Não permita que as bolhas de ar a fluir para o fígado. Uma vez que a reserva de perfusão atinge o fígado, brevemente aperte firme o vaso sanguíneo efluente para criar alguma pressão no vaso e permitir que este líquido encher todos os lóbulos do fígado. Não se esqueça de cortar drenagem muito tempo, como que pode estourar o fino tecido conjuntivo em torno do fígado (cápsula de Glisson) e destruir a perfusão ou fluxo de líquido dentro do leito capilar do fígado. Permita o Buffer 2 com colagenase para perfundir através do fígado, até que todos os 45 mL jorrado através do tecido.Nota: Se for bem sucedida, a cápsula de Glisson deve ser separada do parênquima ou o tecido do fígado e do fígado em si deve aparecer amorfo. Adicionar cerca de 10 mL de tampão 1 ao outro prato cristalização e colocá-lo ao lado do mouse. Remover o cateter e desligar a bomba. Com a pinça reta e tesoura, cortar o fígado de rato. Se a digestão de colagenase foi muito eficiente, pode ser necessário ter uma colher na mão para colher o fígado de rato e coloque-a no Buffer 1 limpa e esterilizada. 4. hepatócito purificação Nota: A manipulação das células são executadas em uma capa de cultura de tecido estéril para limitar a contaminação se as células devem ser cultivadas em todas as etapas subsequentes. Utilizando uma técnica estéril, pegue o fígado com fórceps e agite suavemente as células do fígado. Rasgar ou retirar a cápsula de Glisson: o buffer vai se tornar opaco como células são sacudidas do fígado. Decantar a solução de célula para um Erlenmeyer de 50 mL com um filtro de µm 100 colocados por cima. Adicionar mais 1 de reserva para os remanescentes de fígado e continuar a agitar para fora de células. Continue até o fígado aparece desprovido de células ou quando as partes não digeridas do fígado não produzir mais células. Despeje o líquido celular outro 50ml cónico que contém um filtro de 40 µm. Centrifugue a cónica em um rotor de balde balançando a x 100 g por 3 min.Nota: Não use o freio máximo como isto pode desalojar o centrifugado. Usar o freio em 80%, que é suficiente para todas as restantes etapas de centrifugação a 4 ° C Decantar o sobrenadante (que contém NPCs e hepatócitos mortos) em um Erlenmeyer limpo e coloque-o no gelo. Certifique-se de que isto é feito em um movimento para observar a aderência da pelota. Resuspenda o pellet em 40 mL de tampão 1. Repita os passos de 4.5 e 4.6. Resuspenda o pellet em 40 mL de tampão 3. Repita os passos de 4.5 e 4.6 duas vezes. Resuspenda os hepatócitos purificados no quente DMEM + 10% FBS + 2 x penicilina-estreptomicina (caneta/Strep). Se as células são cultivadas em placas de colágeno revestida, permitir-lhes a aderir por 1h e substituir a mídia pelo menos uma vez como isto impedirá qualquer nascentes contaminantes bacterianos. Fazer as placas de colágeno revestida incubando-os com 0,05% de colágeno em 0,001% de ácido acético pelo menos 1 h a 37 ° C, e então lavando com PBS 1x. Se a viabilidade de hepatócitos é baixa e há um desejo de obter hepatócitos viáveis alta purificados, em seguida, use o seguinte protocolo adaptado de Kramer et al.10. Mix 9 volumes de solução PVP (Percoll, uma solução de w/w de 23% de água e partículas de sílica coloidal de nm de 15-30 revestidas em polivinilpirrolidona para centrifugação de densidade) e 1 volume de 10 x HBSS tornar-se uma solução iso-osmótica de PVP (SIP). Adicione 24 mL de SIP para um estéril 50ml cónico que podem ser armazenado nessas condições por até 2 meses a 4 ° C. Ajuste a concentração de hepatócito a 5-10 × 106 células/mL com meio de cultura, como o observado na etapa 4.8. Adicionar 25 mL de suspensão de células a cada 24 mL contendo cónico de SIP e misture gentilmente por inversão. A densidade desta solução é 1,06 g/mL. Centrifugue o cónico a 50 x g durante 10 minutos a 4 ° C. Aspirar o SIP e o floculante e ressuspender as células em HBSS. Lavar as células por centrifugação a 50 x g durante 10 minutos a 4 ° C. Repita a etapa 4.10.6 mais uma vez e depois Ressuspender as células em meio de crescimento. 5. segundo purificação As células os sobrenadantes da etapa 4.6 de Pelotas, girando os tubos a 163 x g durante 10 min. Descarte os sobrenadantes dos tubos e Resuspenda todos de pelotas de célula em 5 mL de RPMI sem soro e piscina-los juntos em um tubo. Uma vez que todos os chumbos tem sido agrupados, adicione RPMI para volume final de 35 mL. Centrifugue o pool cónico a 25 x g por 3 min. Aspire cuidadosamente com o top 25 mL de RPMI com uma pipeta de 25 mL e coloque essa mídia contendo NPCs em um limpo 50ml cónico no gelo. Adicionar 25 mL de RPMI fresco para o tubo e resuspenda o pellet. Repita a etapa 5.3 para uma segunda lavagem e piscina o sobrenadante. Descarte os restante 10 mL da mídia e da pelota (a pelota consiste principalmente de hepatócitos mortos). Centrifugue o sobrenadante em pool a 163 x g durante 10 minutos. Durante a centrifugação, prepare os gradientes de solução PVP em um Erlenmeyer de 50 mL. Adicione 15 mL de solução PVP 50% para os 50 mL cônica seguido de 20ml de Percoll sobreposto com uma pipeta, definida como a menor velocidade de ejeção de 25%. Certifique-se de observar uma linha de refração na marca 15ml que demarca as duas camadas, como este é onde o SECs e KCs agregará após a centrifugação. Ressuspender as células anteriormente peletizadas em passo 5.5 em 10 mL de RPMI frio e sobrepô-los para o gradiente de solução PVP. Certifique-se de manter uma demarcação clara entre as duas camadas. Centrifugue o gradiente a 805 x g por 20 min com um freio fixado em 50%. Aspire de cima a baixo a direção para a marca de 20 mL no tubo e descartar este material. Com uma pipeta de transferência de 5 mL, colete o SECs e KCs que estão localizados na interface de 25/50%. Descarte qualquer marrons aglomerados de células como estes são hepatócitos mortos. Colocar as células em um 50ml cónico e adicionar RPMI até a marca de 50 mL, diluir a solução de PVP. Centrifugar a 200 x g durante 10 minutos, com 80% de freio. Aspirar e desprezar o sobrenadante e ressuspender o enquanto lava fora do cone das cônicas em 12 mL de RPMI quente. Separar os SECs KCs, colocando o sobrenadante em um prato de Petri de poliestireno e incubá-los numa incubadora de cultura de tecidos umidificado para 8 min à temperatura ambiente. Aspire a mídia com uma pipeta de 25 mL e enxágue a placa com a mesma mídia, com a pipeta definido na menor velocidade para coletar os restantes segundos enquanto as KCs aderir à placa. Centrifugue os segundos a 200 x g por 10 min e Resuspenda em RPMI + 5% FBS + caneta/Strep. Então o título as células e o lugar em pratos de cultura colágeno-revestido.