Purification des hépatocytes et des cellules endothéliales sinusoïdales foie de souris Perfusion

Toutes les procédures animaux décrits dans le présent protocole ont été approuvés par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) à l’Université de Lincoln – Nebraska sous protocole #1435. 1. préparation Préparation de solutions et de milieux de culture Préparer tous les milieux de culture et tampon selon la Table des matières. Préparation des instruments Mettre en place un bain d’eau (> 10 L) à 42 ° C, une pompe péristaltique avec vitesse variable et pinces pour tenir les fioles. Préparer la courbe ciseaux et pinces (Figure 1). Sur ou à proximité de l’eau du bain, mettre en place une plaque de cuisson (environ 38 x 26 cm) avec un tampon de mousse de polystyrène (support conique de 50 mL), recouverte d’une alèse absorbante découper un morceau de 20 x 20 cm (Figure 1). Placez un morceau de ruban adhésif (5-8 cm) à proximité. Place un fil à coudre polyester 20 cm à proximité qui est coupé et prêt à utiliser. Obtenir un cathéter en plastique avec une aiguille rétractable (7 mm x 19 mm, Figure 1). Préparation de la verrerie À l’aide de colliers de serrage, placez et immobiliser une fiole de 1 L dans l’eau du bain contenant 200 mL de solution de 1 PBS x avec un bouchon qui a deux pipettes de 1 mL, entrer dans la solution. Le bouchon en caoutchouc est cranté pour permettre la recirculation de fluide dans un circuit fermé. Avec une autre pince, placer un flacon de 125 mL contenant 45 mL de tampon de 2 avec un bouchon qui a deux pipettes de 1 mL, un dont est dans le liquide vers le bas de la fiole et l’autre qui reste au-dessus du liquide et souffle d’oxygène dans le flacon.NOTE : Chaque pipette dans les bouchons auront un rapide débrancher l’adaptateur attaché à l’extrémité pour la commutation facile du tube. L’oxygène va être courante dans les deux fioles via la pipette dans le bouchon qui n’est pas immergé dans le liquide. Mettre de côté deux plats de cristallisation stériles. 2. animal procédure Réchauffer les solutions PBS et tampon de 2 à 42 ° C dans un bain-marie et faire circuler de PBS pendant au moins 20 mL/min dans la tuyauterie en circuit fermé pour garder les lignes de liquides chaud. Plongez tout excès tube dans le bain d’eau de rester aussi près que possible à 42 ° C. Égoutter l’extrémité mâle du tube dans le PBS contenant de flacon de 1 L. Placer une boule de coton sur l’alèse absorbante et ajouter environ 2 mL de 30 % isoflurane (composé en polyéthylène glycol 200, ce qui diminue le taux d’évaporation d’isoflurane) sur la boule de coton à l’aide d’une pipette de transfert. Soulevez la souris par la queue, placez-le dans le plat de cristallisation et puis rapidement renverser le plat sur la boule de coton pour que la souris a un petit espace dans lequel d’inhaler de l’anesthésie. Respecter le rythme de la respiration de la souris, puis assurez-vous que la souris est effectivement sous anesthésie.Remarque : Le rythme de la respiration doit être plus lente et plus profonde, la queue flasque et les pattes qui ne répondent plus pour le test du pincement sous anesthésie ; Voir lignes directrices IACUC pour plus de détails. Alors que la souris se passe sous anesthésie (cela prend 1-2 min), préparer le Canon d’une seringue de 10 mL en tirant sur le piston et en insérant un petit tampon d’ouate. Ajouter 1 à 2 mL d’isoflurane 30 % avec une pipette de transfert à la boule de coton à l’intérieur du canon et placer le Canon plate vers le bas sur une table pendant que vous attendez d’une attitude inconsciente de la souris. Rapidement enlever le plat cristallisant, retourner la souris sur le dos et placez la seringue sur son nez. Revérifiez le rythme de la respiration, pincement de l’orteil et la queue flasque. Toutes les réponses pour le pincement de l’orteil et la queue flasque indique que la souris n’est pas complètement sous anesthésie. Conserver la seringue sur le museau pour maintenir la perte de conscience. Place des punaises dans les pattes de la souris, avec les membres tendus en décubitus dorsal. Mouillez l’abdomen et la cage thoracique avec alcool isopropylique 70 % ou l’éthanol. Avec la pince droite dans une main, soulevez la peau près de la base de l’abdomen. Avec des ciseaux dans l’autre main, couper la peau tente et le péritoine. L’incision doit être horizontale ou sur la base de la peau de tente. N’oubliez pas de couper à travers toutes les couches de la peau et le péritoine pour accéder à l’intestin. Coupez latéralement autour de l’abdomen jusqu’à la cage thoracique des deux côtés sans entaille tout organe. Couper le lambeau de peau en coupant à travers la cage thoracique inférieure. Déplacer les intestins vers la droite avec le dos de la pince pour exposer la veine porte.NOTE : Saignement de l’animal devrait être minime ; l’animal doit toujours être respirant et sous anesthésie profonde. Placer la pince courbe fermée sous la veine porte entre le foie et la veine pancréatico-duodénale supérieure (flèche de laFigure 3 ). Ouvrez la pince tout en dessous de la veine porte. Saisissez le fil et tirez soigneusement à travers afin qu’elle soit centrée au-dessous de la veine porte. Attacher un noeud autour de la veine porte sans moulants il vers le bas. Placer la pince courbée sous la veine porte et tirer doucement vers la queue de la souris pour redresser la veine (Figure 4A). Une fois le cathéter dans l’autre main, placez le biseau de l’aiguille face vers le haut et parallèle à la partie inférieure de la veine porte près de la pince (Figure 4B). Percer délicatement la veine avec l’aiguille (Figure 4C). Assurez-vous que le biseau de l’aiguille est dans la lumière de la veine. Rétracter l’aiguille à ressort et continuer à pousser le cathéter de polymère dans la veine, jusqu’à ce que le biseau est proche du quartier ramifié veineux. C’est dans le foie. Si le cathéter est placé correctement, un reflux de sang seront visible. (Figure 4D). Serrer le noeud et tirez-le vers le bas sur le cathéter pour aider à stabiliser. Immédiatement, baissez la vitesse de la pompe de 20 mL/min à 4 mL/min et couper un autre vaisseau sanguin majeur pour le drainage. Couper l’abdominalis aorte pour des résultats optimaux. Placez l’extrémité mâle du tube à l’extrémité femelle du cathéter (Figure 5A). S’assurer qu’il n’y a pas de bulles d’air dans la ligne. Veillez à ce que le cathéter n’est pas non plus poussé au niveau du foie ou de la veine. Placement du fil n’est pas essentiel, mais il aide à prévenir le reflux de la veine et permet de maintenir le cathéter dans la bonne position (Figure 5B, C). Utilisez du ruban pour immobiliser le tuyau sur l’alèse. Utiliser la pince droite à serrer l’effluent vaisseau sanguin pour gonfler le foie plusieurs fois pour s’assurer que tout le sang est drainé (Figure 5D).NOTE : Bande de laboratoire Standard peut-être ne pas fonctionner ; Cependant, du ruban reste coincé à l’alèse, même dans des conditions humides. 3. foie Perfusion Alors que le foie est rinçage à PBS, mesurer environ 24 mg de collagénase de Type IV et l’introduire dans la fiole contenant 45 mL de tampon de 2 dans le bain d’eau. N’oubliez pas d’agiter le liquide dans le vase afin que la collagénase est entièrement dissous et placer le ballon dans la pince afin que la fraction liquide contenant du ballon est complètement submergée dans l’eau. Observez le changement de couleur du foie il est rincé avec du PBS. Changer le tuyau de sortie du flacon de 1 L pour le flacon de 125 mL. Ne pas laisser de bulles d’air à s’écouler dans le foie. Une fois que le tampon de perfusion atteint le foie, brièvement squeeze serré le vaisseau sanguin effluent développer une pression à l’intérieur du navire et de laisser ce liquide remplir tous les lobes du foie. Être sûr de ne pas couper de drainage trop longtemps, car qui pourrait éclater le mince tissu conjonctif qui entoure le foie (capsule de Glisson) et détruire la perfusion ou du débit de liquide dans le lit capillaire du foie. Laisser 2 tampon avec la collagénase à perfuse par le foie jusqu’à ce que tous les 45 mL ont coulé à travers le tissu.Remarque : En cas de succès, capsule de la Glisson doit être séparé par le parenchyme ou le tissu hépatique et le foie lui-même devrait apparaître amorphe. Ajouter environ 10 mL de tampon de 1 à la cristallisation autre plat et placez-le à côté de la souris. Retirer le cathéter et arrêtez la pompe. Avec la droite pinces et ciseaux, couper le foie de la souris. Si la digestion de collagénase était très efficace, il peut être nécessaire d’avoir une cuillère propre et stérile sur la main pour ramasser le foie de la souris et le placer dans le tampon de 1. 4. Purification de l’hépatocyte NOTE : La Manipulation des cellules sont effectuées sous une hotte de vitroplants stérile pour limiter la contamination si les cellules sont cultivées dans toutes les étapes subséquentes. Utilisant une technique stérile, saisir le foie avec une pince et secouez doucement les cellules du foie. Déchirer ou reculer la capsule de la Glisson : le tampon deviendra opaque que les cellules sont secouées par le foie. Décanter la solution de cellule dans une conique de 50 mL avec 100 µm filtre placé sur le dessus. Ajouter plus de mémoire tampon 1 aux restes du foie et continuer à secouer les cellules. Continuez jusqu’à ce que le foie apparaît dépourvu de cellules ou lorsque les parties non digérées du foie ne donnent pas plus les cellules. Verser le liquide cellulaire dans une autre de 50 mL conique contenant un filtre à 40 µm. Centrifuger conique dans un rotor oscillant de seau à 100 x g pendant 3 min.Remarque : N’utilisez pas le frein maximum comme cela peut déloger le culot cellulaire. Utilisez le frein à 80 %, ce qui suffit pour toutes les autres étapes de centrifugation à 4 ° C Décanter le liquide surnageant (qui contient des PNJ et des hépatocytes morts) dans une propre conique et placez-le sur la glace. S’assurer que cela se fait en un seul mouvement pour observer le respect des granulés. Resuspendre le culot dans 40 mL de tampon de 1. Répétez les étapes 4.5 et 4.6. Resuspendre le culot dans 40 mL de tampon de 3. Répétez les étapes 4.5 et 4.6 deux fois. Remettre en suspension les hépatocytes purifiées à chaud DMEM + 10 % BF + 2 x la pénicilline-streptomycine (Pen/Strep). Si les cellules sont cultivées sur des plaques de collagène enduit, permettez-leur de respecter pendant 1 h et remplacer les médias au moins une fois car cela empêchera toute naissantes contaminants bactériens. Rendre les plaques de collagène recouvert en incubant eux avec le collagène de 0,05 % à 0,001 % d’acide acétique pendant au moins 1 h à 37 ° C et laver ensuite avec du PBS 1 x. Si la viabilité de l’hépatocyte est faible et il y a un désir d’obtenir des hépatocytes viables haute purifiés puis utilisez le protocole suivant, adapté de Kreamer et al.10. Mélanger 9 volumes de la solution PVP (Percoll, une solution de p/p de 23 % de l’eau et de particules de silice colloïdale 15 à 30 nm recouvert de polyvinylpyrrolidone pour la centrifugation de densité) et 1 volume de 10 x HBSS pour faire une solution iso-osmotique de PVP (SIP). Ajouter 24 mL de SIP dans un stérile 50 mL conique qui peut être stocké dans ces conditions pendant 2 mois à 4 ° C. Ajuster la concentration d’hépatocytes à 5-10 × 106 cellules/mL avec milieu de culture tel que celui noté à l’étape 4,8. Ajouter 25 mL de suspension cellulaire à chaque 24 mL SIP contenant conique et mélanger doucement par retournements. La densité de cette solution est de 1,06 g/mL. Centrifuger conique à 50 x g pendant 10 min à 4 ° C. Aspirer le SIP et le floculant et remettre en suspension les cellules HBSS. Laver les cellules par centrifugation à 50 x g pendant 10 min à 4 ° C. Répétez l’étape 4.10.6 une fois de plus et puis remettre en suspension les cellules dans un milieu de croissance. 5. SEC Purification Les cellules dans les surnageants de l’étape de 4,6 à pellets en faisant tourner les tubes à 163 x g pendant 10 min. Jetez les surnageants des tubes et tous les granulés de la cellule de resuspendre dans 5 mL de RPMI sans sérum et les regrouper dans un seul tube. Une fois toutes les boulettes ont été mis en commun, ajoute RPMI pour un volume final de 35 mL. Centrifuger le pool conique à 25 g pour 3 min. aspirer soigneusement le haut de la page 25 mL de RPMI avec une pipette 25 mL et place ce média contenant des PNJs dans une propre 50 mL conique sur la glace. Ajouter 25 mL de RPMI frais vers le tube et Resuspendre le culot. Répétez l’étape 5.3 pour un second lavage et piscine le surnageant. Jeter le reste 10 mL de médias et pellet (le culot se compose principalement d’hépatocytes morts). Centrifuger le surnageant regroupé à 163 x g pendant 10 min. Au cours de la centrifugation, préparer les gradients de solution PVP dans un 50 mL conique. Ajouter 15 mL de solution PVP de 50 % pour les 50 mL conique puis 20 mL de 25 % Percoll superposé avec une pipette à régler à la vitesse la plus lente d’éjection. Veillez à respecter une ligne de réfraction à la marque de 15 mL qui délimite les deux couches, car c’est où le SECs et KCs regroupera après la centrifugation. Remettre en suspension les cellules précédemment granulées dans étape 5.5 dans 10 mL de RPMI froid et tu les couvriras sur le gradient de solution PVP. Veillez à maintenir une ligne de démarcation claire entre les deux couches. Centrifuger le gradient à 805 x g pendant 20 min avec un frein réglé à 50 %. Aspirer de haut en bas la direction de la marque sur le tube de 20 mL et de jeter ce matériel. Avec une pipette de 5 mL, recueillir les SECs et KCs qui sont situés à l’interface de 25/50 %. Jeter tout amas bruns des cellules car ce sont les hépatocytes morts. Mettre les cellules dans un 50 mL conique et RPMI jusqu’au repère de 50 mL à diluer la solution de PVP. Centrifuger à 200 x g pendant 10 min, avec frein à 80 %. Aspirer et éliminer le surnageant et Resuspendre le culot en lavant hors du cône de la conique dans 12 mL de RPMI chaud. Séparer les SECs de KCs en plaçant le surnageant dans un polystyrène boîte de Pétri et incuber dans un incubateur de culture de tissu humidifié pendant 8 min à température ambiante. Aspirer les médias avec une pipette 25 mL et rincer la plaque avec le même média, avec la pipette fixé à la vitesse la plus basse pour recueillir les restants SECs tout en les KCs adhère à la plaque. Centrifuger les SECs à 200 x g pendant 10 min et resuspendre dans RPMI + 5 % BF + stylo/Strep. Puis le titre les cellules et place dans Pétri recouvertes de collagène.