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Cancer Research

Charakterisierung von Tumorzellen mit einem medizinischen Draht zur Erfassung von zirkulierenden Tumorzellen: 3D Ansatz basierend auf Immunfluoreszenz und DNA-Fisch

Published: December 21, 2017
doi:
10.3791/56936
, , , ,
1Biosciences Laboratory,Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS, 2Associazione Annastaccatolisa Onlus, 3Nuclear Medicine Unit,Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS

Summary

Wir präsentieren einen neuen Ansatz zur Charakterisierung von Tumorzellen. Wir kombinierten Immunfluoreszenz mit DNA-Fluoreszenz –in-Situ-Hybridisierung auszuwertende Zellen erfasst durch einen funktionalisierten medizinische Draht in der Lage, in Vivo CTCs direkt aus Patientenblut zu bereichern.

Abstract

Zirkulierende Tumorzellen sind (CTC) zugeordnet schlechte Überleben bei metastasiertem Krebs. Ihre Identifikation, Phänotypisierung und Genotypisierung könnte führen zu einem besseren Verständnis der Tumor Heterogenität und erleichtern die Auswahl der Patienten für eine individuelle Behandlung. Allerdings ist dies aufgrund der Seltenheit von CTCs behindert. Wir präsentieren Ihnen einen innovativen Ansatz für ein hohes Volumen an das Patientenblut Probenahme- und Informationsbeschaffung über Präsenz, Phänotyp und gen Translokation des CTC. Die Methode verbindet Immunfluoreszenz-Färbung und DNA-Leuchtstoff –in-Situ-Hybridisierung (DNA-Fisch) und basiert auf einer funktionalisierten medizinische Leitung. Dieser Draht ist ein innovatives Gerät, das die in Vivo -Isolierung von CTCs aus ein großes Volumen des peripheren Blutes ermöglicht. Das Blutvolumen, abgeschirmt durch einen 30-min-Administration des Drahtes ist etwa 1,5-3 L. Um die Machbarkeit dieses Ansatzes zu demonstrieren, Epithelzelle Adhäsion Molekül (EpCAM) Ausdruck und die chromosomale Translokation des ALK-Gens wurden in nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NSCLC) Krebszelllinien gefangen genommen von der funktionalisierten Draht bestimmt und gefärbt mit einem Immuno-DNA-Fisch-Ansatz. Unsere größte Herausforderung war den Test auf eine 3D-Struktur der funktionalisierten Draht durchführen und Immuno-Phänotyp bestimmen und Fisch-Signale auf das unterstützen mit einem herkömmlichen Fluoreszenzmikroskop. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass CTCs abfangen und analysieren deren Phänotyp und chromosomale Umstellung könnte potenziell stellen einen neuen Begleiter diagnostischen Ansatz dar und eine innovative bieten Strategie zur Verbesserung der personalisierten Krebstherapie.

Introduction

CTC repräsentieren einen wichtigen Schritt der Krebs Zelle Verbreitung1. Ihre Anwesenheit im peripheren Blut des Patienten ist (metastatische) Rezidiv und Krankheit Fortschreiten2,3zugeordnet. CTC-Isolierung und Charakterisierung aus dem Blut von Krebspatienten ist eine Art von nicht-invasiven Flüssigbiopsie. In den letzten Jahren immer deutlicher geworden, dass die Überwachung von Fortschritt und Reaktion der Tumoren auf verschiedene Behandlungen, die mit dieser Art von Analyse liefert wichtige klinische Informationen4,5. Flüssigbiopsie ist noch nützlicher, wenn Chirurgie nicht möglich ist oder wenn die primären Tumorgewebe nicht verfügbar, ist alsofür nicht-Biopsiable Läsionen. Daher ist dieser Ansatz vielversprechend in bestimmten Krebs-Einstellungen wie metastasiertem NSCLC, wo die Anwesenheit von CTCs nachgewiesen wurde eine negative prognostische Rolle6haben. NSCLC ist ein Tumor, der profitiert vor allem von zielgerichtete Therapieansätze7,8,9 entwickelt, um auf bestimmte Moleküle (molekulare Targets) bekannt, in dem Wachstum, Fortschritt, einbezogen zu handeln und Ausbreitung der Krankheit. Daher ist die Erkennung von spezifischen Ziele während der Progression der Erkrankung erforderlich. CTC-Untersuchung ist eine äußerst interessante diagnostischen Ansatz zu erkennen und zu überwachen Drogeziele ohne die Notwendigkeit einer primären oder metastatischen Gewebes. Beispielsweise ist die Erkennung von ALK-gen Translokationen in NSCLC Zellen mit Sensibilität für Crizotinib, eine spezifische gezielte Therapie10verbunden. Allerdings ist die Erkennung von ALK Translokationen derzeit nur auf fein-Nadel-Aspiraten oder kleinen Biopsien ausgeführt; Infolgedessen ist ohne einen Tumor Gewebe ALK Analyse nicht möglich. CTC sind eine mögliche Alternative zu Tumor Gewebe-basierte Untersuchungen und stellen einen vielversprechenden Begleiter diagnostischen Ansatz dar.

Trotz ihrer potenziellen Bedeutung unterliegen CTCs noch eine große Debatte unter Forschung, vor allem wegen ihrer Seltenheit (1-10 Zellen/mL peripherem Blut11). Aktuelle flüssigen Biopsie-Methoden verwenden eine begrenzte Menge an Blut (d.h., 1-30 mL)12,13, aber dadurch entsteht eine Situation der suboptimalen Sensitivität für den Nachweis von CTCs. daher, Forschung ist gerechtfertigt, um die Feststellung Ansätze und entwickelnden Geräte flüssigen Biopsien CTC gezielt auf ein größeres Volumen des peripheren Blutes durchführen.

Ein alternatives Gerät, einen funktionalisierten medizinische Draht (siehe Tabelle der Materialien), wurde entwickelt, um Blut Probenahme Grenzen zu überwinden und eine repräsentative Analyse der CTC erhalten. Dieser funktionalisierten Draht ist eine CE-Zulassung medizinisches Gerät, das direkt aus dem Blutkreislauf des Krebs Patienten1CTCs erfasst. Mit einer 2-cm-langen funktionalisierten Spitze beschichtet mit einer 0,2 µm dicke Schicht aus Gold besteht aus einem 16 cm lange Edelstahl-Draht (Abbildung 1a). Die Schicht wird wiederum durch eine 1 bis 5 µm dicken Polycarboxylatether Hydrogel Schicht kovalent verbunden mit Antikörper gegen EpCAM, eines der am häufigsten exprimierten Antigene auf der Oberfläche des CTC14abgedeckt. Die funktionalisierten Spitze des Drahtes wird in eine Vene des Arms des Patienten eingeführt und bleibt in Position für mindestens 30 Minuten. Dieser Ansatz ermöglicht Isolation von CTCs in-vivo, direkt im peripheren Blut und Bildschirm etwa 1,5-3,0 L Blut (ca. 300-fold mehr als das Volumen für alternative Ansätze verwendet)1.

Pantel Et Al. demonstriert die Wirksamkeit dieses Ansatzes CTCs direkt in die Arm-Venen der Lunge-Krebs-Patienten-15zu isolieren. Sie führten Draht Immunfluoreszenz Färbung CTCs mit herkömmlichen Antikörper gegen EpCAM und Pan-Cytokeratin und CD45 für äußerst Erkennung identifizieren. Der Draht wurde unter eine optische Fluoreszenz-Mikroskop-15untersucht. Die Autoren zeigten, dass das Gerät in der Lage war, CTCs zu isolieren, aber sie keine Therapie-bezogenen Ziele, wie ALK Translokationen untersuchen.

Die vorgestellte Methode soll vermeintliche CTCs in NSCLC-Zell-Linien auf der Grundlage der phänotypischen Parameter, z.B., EpCAM Positivität und das Vorhandensein von molekularen Biomarker, zum Beispiel den ALK-Status (Abbildung 1 b) zu ermitteln. Dieses 3-Tages-langen Verfahren kombiniert einen funktionalisierten Draht und Immunfluoreszenz-Färbung mit DNA-Fluoreszenz –in-Situ-Hybridisierung (DNA-Fisch), Immuno-DNA-Fisch benannt. Da die CTCs seltene Entitäten sind, ist der Vorteil dieses Protokolls, dass auf dem gleichen Draht in Bezug auf Immunophenotypic Funktionen und DNA Rearrangements CTCs charakterisiert werden können.

Protocol

1. Immuno-DNA Fisch auf einem 2D Deckgläschen Deckglas Vorbereitung und anhaftende Zelle AussaatHinweis: Führen Sie die folgenden Schritte unter einem laminar-Flow-Haube unter sterilen Bedingungen. Tauchen Sie das Deckglas in 100 % igem Ethanol um sie zu desinfizieren.Hinweis: Wir verwenden 12 mm × 12 mm Silikon-gestützten quadrierten Deckgläsern (alle Reagenzien sind in der Tabelle der Materialienaufgeführt). Platzieren Sie die Deckgläsern in einer Petrischale (100 mm Durchmesser). Trocken mit gezwungen Luftstrom für 5 Minuten. Waschen der Petrischale mit 15 mL steril 1 × Dulbecco Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS). Waschen Sie die Petrischale mit 10 mL der kompletten Medium (siehe Tabelle 1). Seed adhärente Zellen (etwa 1.650.000 Zellen in 10 mL Medium, gezählt von FACS-Analyse) durch sanft Fallenlassen der Zellsuspension auf der Petrischale, einheitliche Zelle Beschichtung (ca. 30.000 Zellen/cm2) zu erhalten.Hinweis: Bei ~ 70 % Zusammenströmen, adhärenten Zellen auf Deckgläsern für mindestens 48 Stunden kultiviert werden sollten. Fixierung und PermeabilisierungAchtung: Aceton ist eine brennbare und irritierend flüchtige Substanz. Verwenden Sie nur Aceton-resistenten Kunststoff oder Glasbehälter (kein PVC oder PVDF).Hinweis: Führen Sie diese Schritte unter einem chemischen Abzug. Entfernen Sie das Kulturmedium mit einem Einweg-Absaugnadeln pipettieren. Waschen Sie die Petrischale mit 1 × PBS. Mit einer Pinzette, waschen Sie die Deckgläsern durch Eintauchen in ein Becherglas mit 5 mL 1 × PBS. Trocknen Sie die Deckgläsern auf Löschpapier. Befestigen Sie die Zellen auf dem Deckglas durch Eintauchen in eine 100 %-Aceton-Lösung für 10 min bei Raumtemperatur (RT). Entfernen Sie das Deckglas mit einer Pinzette. Trocknen Sie Deckglas mit eine erzwungene Luftströmung für 5 min.Hinweis: Das Protokoll kann an dieser Stelle angehalten werden. Das Deckglas sollte bei-20 ° c gelagert werden Immunfluoreszenz-Tag 1Hinweis: Diese Phase beinhaltet eine Übernachtung (O/N) Inkubation (~ 16 h). Waschen Sie die Deckgläsern zweimal in 1 × PBS. Drop 100 µL Antikörper Verdünnungspuffer (siehe Tabelle 1 für Details) auf das Deckglas und 30 min bei RT inkubierenHinweis: Auf der Grundlage der Deckglas Oberfläche um die gesamte Deckglas abdecken und vermeiden das Risiko der Überlauf sollte Lösung Volumen angepasst werden. Vorbereiten den Antikörper-Mix (Tabelle 1) mit einem 01:20 Verdünnung von monoklonalen Primärantikörper konjugiert mit Fluorochrom und Antikörper Verdünnungspuffer, wie in dem Datenblatt des Herstellers angegeben.Hinweis: Es wird dringend empfohlen, monoklonale Antikörper konjugiert mit thermostabile Fluorochrom zu verwenden. Wenn ein nicht-thermostabile Fluorochrom verwendet wird, kann die Temperatur während der DNA-Fisch-Schritte des Protokolls genutzt beschädigen die Fluorochrom und fluoreszierenden Emissionen zu löschen. In diesem Protokoll, wir entschieden uns für einen EpCAM-FITC Antikörper (01:20 Verdünnung), die keine erheblichen Probleme mit der eingesetzten Temperatur nicht zeigen. Spülen Sie die Deckgläsern zweimal in 1 × PBS. Stellen Sie Deckgläsern Zelle-Seite nach oben in eine feuchte Kammer- and -Drop 100 µL des Antikörper-Mix auf dem Deckglas.Hinweis: Volumen der Lösung sollte auf der Grundlage der Deckglas Oberfläche zur Deckung der gesamten Deckglas und verringern das Risiko eines Überlaufs angepasst werden. O/N inkubieren (~ 16 h) im Dunkeln bei 4 ° C. Immunfluoreszenz-Tag 2 Blockieren Sie Antikörper Inkubationszeit durch den Deckgläsern zweimal in 1 × PBS waschen.Hinweis: Laden inmitten der Deckgläsern 100 µL 1 × PBS bei 4 ° C in einer Kammer mit konstanter Luftfeuchtigkeit im Dunkeln bis der FISH-Test durchgeführt wird. 2D DNA-Fisch-Tag 2Achtung: Besondere Aufmerksamkeit muss auf die hohe Temperatur der Instrumente und der feuchten Kammer. Einrichten der Hybridisierung Ofen und trockene Hitze-Ofen (~ 3 h vor dem Start der DNA-FISH-Protokoll). Festlegen der Hybridisierung Ofen bei 75 ° C, trockene Hitze Backofen bei 37 ° C eingestellt und kühlen 0.4 × SSC Lösung (pH = 7,0 ± 0,1) (SSC Rezept siehe Tabelle 1) bis 4 ° C.Hinweis: pH-Status des Fisch-Puffer ist wichtig: pH = 7,0 ± 0,1. Waschen Sie das Deckglas in eiskalten 0.4 × SSC Lösung dreimal. Trocknen Sie das Deckglas unter einem chemischen Abzug für 10 min in der Dunkelheit. Wirbel für 10 s, und führen Sie einen schnelle Spin-down (mit maximalen Rate) der Sonde von der Wand von der Sonde. Legen Sie die Deckglas Zelle-Seite nach unten auf einen Rückgang von 5 µL Fisch Sonde auf einer Rutsche und einer Dichtung alle Kanten des Deckglases mit Gummilösung.Achtung: Die nächsten beiden Schritte beinhalten hohe Temperaturen. Tragen Sie Schutzhandschuhe. Legen Sie die Folie in eine dunkle feuchte Kammer im Ofen für 8 min bei 75 ° C für vollständige Denaturierung der DNA-Hybridisierung. Verschieben Sie die feuchte Kammer in trockener Hitze Backofen bei 37 ° C O/N. 2D DNA-Fisch-Tag 3 Im Wasserbad bei 72 ° C eingestellt und legen Sie eine Folie Färbung Glas mit 0,4 × SSC-Puffer hinein (Tabelle 1). Nach 30 min, überprüfen Sie die Temperatur des Puffers 0.4 × SSC, die sein müssen, bei 72 ± 1 ° C. Bereiten Sie zwei Glas Becher: mit 2 × SSC + 0,05 % Tween-Puffer (pH = 7,0 ± 0,1) (Tabelle 1) und einen zweiten mit destilliertem Wasser. Die feuchte Kammer aus dem Ofen nehmen, sorgfältig die Gummilösung aus der Folie entfernen und das Deckglas mit einer Pinzette zu lösen. Waschen Sie das Deckglas durch Eintauchen in 0.4 × SSC für 2 min bei 72 ° C. Waschen Sie das Deckglas durch Eintauchen in 2 × SSC + 0,05 % Tween Puffer für 30 s. Spülen Sie das Deckglas in destilliertem Wasser. Trocknen Sie die Deckgläsern unter einem chemischen Abzug für 10 min in der Dunkelheit. Montieren Sie das Deckglas in flüssigen Eindeckmittel mit 1,5 µg/mL 4´, 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI), Gesamt-DNA Gegenfärbung. Legen Sie die Deckglas Zelle-Seite nach unten auf einen Rückgang von 5 µL Eindeckmedium auf einer Folie, drücken Sie die Pinzette auf das Deckglas, die Luft heraus zu bekommen, und mit Nagellack versiegeln.Hinweis: Montage mittleren Lautstärke sollte auf der Grundlage der Größe des Deckglases Oberfläche angepasst werden. 2D Mikroskop Beobachtung und AnalyseHinweis: Bilder können mit verschiedenen Mikroskopsystemen erworben werden.Wir haben eine konventionelle Leuchtstofflampen Mikroskop mit einer kommerziellen Standardsoftware für die Bildaufnahme (Table of Materials) ausgestattet. Abrufen von Bildern mit einem 12-Bit digital-Kamera und 20 × / 0,50 NA und 40 × / 0,65 NA Ziel mit entsprechenden Filtern für rot (Anregung: 599 nm, Emission: 588 nm), grün (Anregung: 509, Emission: 524), und blau (Anregung: 367 nm, Emission: 452 nm) Sonden. Analysieren von Bildern mit Softwaretool der Wahl.Hinweis: Um die Immunfluoreszenz-Färbung und der ALK-Sonde Lokalisierung zu bewerten, haben wir ImageJ. Folien können bei-20 ° C im Dunkeln für maximal 3 Wochen gespeichert werden. Für längere Lagerung empfehlen wir, mit spezifischen Eindeckmedium für langfristige Lagerung. (2) Immuno-DNA Fisch auf Draht Zelle Spike-Line-in auf Draht (3D-Unterstützung)Hinweis: Vorläufige Aufstellung beinhaltet eine genaue Auswahl der adhärenten Zellen Linien auf EpCAM-Positivität. Der Draht ist mit Anti-EpCAM Antikörper funktionalisiert, so dass nur EpCAM-positiven Zellen gefärbt sind.Hinweis: Berühren Sie nicht die funktionalisierten Teil des Drahtes um Beschädigungen zu vermeiden.Hinweis: Alle Schritte sollten unter einem Laminar-Flow-Haube in sterilen Bedingungen durchgeführt werden. Aufschwemmen Sie der gesamte Inhalt einer Flasche T75 (80 % Zusammenfluss) in eine 5 mL-Fläschchen mit 4 mL des kompletten Medium; für ein einzelnes Spike-in sollten etwa 2.000.000 Zellen Zellen Adhäsion an den Draht zu maximieren. Entfernen Sie das Kabel aus der Glasverpackung. Tauchen Sie die funktionalisierten gold Teil des Drahtes in das Fläschchen, um sicherzustellen, dass der Draht-Stopper eine wasserdichte das Fläschchen passt. Seal mit Labor-Film.Hinweis: Die Verwendung von 5 mL-Tube wird empfohlen, um eine korrekte Übereinstimmung zwischen der Draht-Stopper und das Fläschchen zu ermöglichen. 30 min bei RT in ein Rohr Rotator inkubieren (0-120 Winkel). Spülen Sie den Draht dreimal in 1 × PBS-Lösung mit 3 verschiedenen sauberen Fläschchen. Fixierung und PermeabilisierungAchtung: Aceton ist eine brennbare Substanz, die die Atemwege reizen kann. Verwenden Sie nur Aceton-beständige Kunststoff- oder Glasbehälter (kein PVC oder PVDF).Hinweis: Führen Sie diese Schritte unter einem chemischen Abzug. Trocknen Sie den Draht an der Luft. Befestigen Sie den Zellen durch Eintauchen des Drahtes in Aceton 100 % Lösung für 10 min bei RT. Nutzung eine 5 mL-Tube.Hinweis: Der Draht-Stopper muss nicht das Fixiermittel in Berührung. An der Luft trocknen der Leitung für 5 min bei RTHinweis: Das Protokoll kann hier angehalten werden. Der Draht muss bei-20 ° c gelagert werden Wenn den Draht für die langfristige Lagerung, Verpackung, legen Sie den Draht-Stopper neben der funktionalisierten Spitze und legen Sie den Draht in die Lagerung Glasrohr, kümmert sich nicht um die funktionalisierten Spitze beschädigen. Schließen Sie das Speicher-Glas und speichern Sie (vertikal oder horizontal) bei-20 ° C. Immunfluoreszenz-Tag 1Hinweis: Diese Phase beinhaltet eine O/N Inkubation (~ 16 h). Waschen Sie zweimal in 1 × PBS-Lösung mit 5 mL Tube. Inkubieren Sie den Draht in Verdünnungspuffer Antikörper für 30 min bei RT mit 5 mL Tube. Bereiten Sie 150 µL Antikörper-Mix mit einer Verdünnung von monoklonalen Primärantikörper konjugiert mit Fluorochrom in Verdünnungspuffer Antikörper, wie im Datenblatt angegeben. EpCAM-FITC Antikörper wurde z. B. mit einem 01:20 Verdünnung. Verwenden Sie einen p200 Tipp Inkubation wie folgt durchführen: Auszug den Draht aus der Draht-Stopper und sanft stecken Sie das Kabel durch die größere Öffnung an der Spitze. Einführen Sie unfunctionalized Ende zuerst und ziehen Sie den Draht durch das kleinere Loch langsam, bis das gold direkt hinter das größere Loch ist. Sanft fallen 150 µL des Antikörper-Mix (z. B. anti-EpCAM_FITC Antikörper 01:20 verdünnt) in die Spitze. Um die Gefahr von Blasenbildung zu vermeiden, wirbeln Sie sanft den Draht, bis der funktionalisierten Teil komplett getaucht wird. Seal bis das Loch an der Spitze. Labor-Film um das Loch wickeln kann helfen. Inkubieren Sie vertikal O/N (~ 16 h) im Dunkeln bei 4 ° C. Immunfluoreszenz-Tag 2 Blockieren Sie Antikörper Inkubationszeit durch den Draht zweimal in 1 × PBS waschen. Setzen Sie den Draht in die Draht-stopfen.Hinweis: Laden in 1 X PBS bei 4 ° C in 5 mL Fläschchen bis der FISH-Test durchgeführt wird. 3D-FISCHE DNA-Tag 2Achtung: Besondere Aufmerksamkeit muss auf die hohe Temperatur der Instrumente und feuchte Kammer. Einrichten der Hybridisierung Ofen und trockene Hitze-Ofen (~ 3 h vor dem Start der DNA-FISH-Protokoll). Hybridisierung Ofen bei 75 ° C eingestellt, die trockene Hitze Backofen bei 37 ° C eingestellt und kühlen die 0.4 × SSC-Lösung (pH = 7,0 ± 0,1) bis 4 ° C.Hinweis: Der pH-Status der Fisch Puffer ist von entscheidender Bedeutung und muss 7,0 ± 0,1. Waschen Sie den Draht 3 Mal im eiskalten 0.4 × SSC-Lösung.Hinweis: Halten Sie den Draht im Dunkeln Fluorochrom Immunofluoreszenz bei den folgenden Verfahren zu vermeiden. 10 min in der Dunkelheit unter dem Laborabzug trocknen lassen. Wirbel und drehen Sie die Sonde für 5 s. Sollte Mikroröhrchen 10 µL der Sonde ablegen. Deckel mit Labor-Film. Drehen Sie die Mikroröhrchen wie folgt: wickeln Sie die Reaktionscup in einem trockenen, saugfähigen, Papier Put in ein 50-mL-Röhrchen, und drehen Sie kurz. Sorgfältig den getrockneten Draht in die Reaktionscup und schieben Sie den Draht-Stopper. Mit Gummilösung abdichten.Achtung: Die nächsten beiden Schritte beinhalten hohe Temperaturen.Tragen Sie Schutzhandschuhe. Legen Sie den Draht in eine dunkle feuchte Kammer im Ofen für 8 min bei 75 ° C zu vollständigen Denaturierung der DNA-Hybridisierung. Verschieben Sie die feuchte Kammer in eine trockene Hitze Backofen bei 37 ° C O/N. 3D-FISCHE DNA-Tag 3 Setzen Sie eine Folie, die Färbung von Glas mit 0,4 × SSC-Lösung in ein Wasserbad und legen Sie bei 72 ° C. Überprüfen Sie die Temperatur der Lösung 0,4 × SSC bis zu 72 ± 1 ° C. Bereiten Sie zwei Glas Becher, mit 2 × SSC + 0,05 % Tween (pH = 7,0 ± 0,1) Lösung und die zweite mit destilliertem Wasser. Die feuchte Kammer aus dem Ofen trockene Hitze zu entfernen, entfernen Sie vorsichtig die Gummilösung aus der Draht-Stopper mit einer Pinzette, und nehmen Sie den Draht.Hinweis: Ziehen Sie vorsichtig das unbeschichtete Ende des Drahtes durch die IN-Stopper, ohne dabei die funktionalisierten Spitze beschädigen. Tauchen Sie den Draht in die 0.4 × SSC-Lösung für 2 min bei 72 ° C. Waschen Sie den Draht in 2 × SSC + 0,05 % Tween-Lösung für 30 s bei RT Waschen Sie den Draht in destilliertem Wasser bei RT Trocknen Sie den Draht unter dem Abzug für 10 min in der Dunkelheit. Bereiten Sie eine DAPI-Stammlösung von 1,43 µM in 2 mL 1 × PBS. Inkubieren Sie die funktionalisierten Spitze des Drahtes mit DAPI-Lösung in einem 2 mL Fläschchen für 1 h im Dunkeln bei RT Den Draht in 1 × PBS zweimal spülen und trocknen. 3D Mikroskop Beobachtung und Analyse Positionieren Sie den Draht in die Drahthalter. Legen Sie die funktionalisierten Spitze durch den Einstiegspunkt für die spezielle Halterung, bis die Spitze Kopplungspunkt entspricht. Achten Sie darauf, dass Sie nicht die funktionalisierten Spitze (Abbildung 1a) beschädigen. Legen Sie die spezielle Halterung auf den Mikroskoptisch. Stellen Sie den Fokus des Mikroskops mit einem 20 × Objektiv. Zunächst grob auf die besondere Unterstützung und passen Sie dann fein auf Zellen, die im DAPI-Kanal hell erscheinen. Setzen Sie in den Mittelpunkt die Zellen erst zentral für das Objektiv.Hinweis: Bilder können mit verschiedenen Mikroskopsystemen erworben werden. In dieser Einstellung verwenden wir eine konventionelle Leuchtstofflampen Mikroskop ausgestattet mit einer kaufmännischen Standardsoftware für die Bildaufnahme. Abrufen von Bildern mit einem 12-Bit digital-Kamera und 20 × / 0,50 NA und 40 × / 0,65 NA Ziel mit entsprechenden Filtern für rot (Anregung: 599 nm, Emission: 588 nm), grün (Anregung: 509, Emission: 524), und blau (Anregung: 367 nm, Emission: 452 nm) Sonden.Hinweis: Bilder können mit verschiedenen Tools und Software visualisiert werden. Wir verwenden ImageJ, um Immunfluoreszenz-Färbung und ALK-Sonde Lokalisierung zu bewerten.Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten werden. Der Draht muss bei-20 ° c gelagert werden Wenn den Draht für die langfristige Lagerung, Verpackung, legen Sie den Draht-Stopper neben der funktionalisierten Spitze und legen Sie den Draht in die Lagerung Glasrohr, kümmert sich nicht um die funktionalisierten Spitze beschädigen. Schließen Sie das Speicher-Glas und speichern Sie (vertikal oder horizontal) bei-20 ° C.

Representative Results

Verwendung des oben beschriebenen Verfahrens ist möglich, einen Fisch Immuno-DNA-Test auf CTCs (oder anderen gleichwertigen Zellen) bereichert durch die funktionalisierten Draht durchzuführen. Vor der Inbetriebnahme dieses Protokolls war die Kompatibilität der beiden Techniken bestimmt (Immuno-Fluoreszenz mit Fisch) auf standard 2D unterstützt. Zwei verschiedenen NSCLC Zell-Linien mit dem Ausdruck EpCAM (verpflichtet, sich an den Draht gepaart mit Antikörper gegen EpCAM) wurden ausgewählt. Sie haben einen anderen ALK-Status, ist nützlich, um unterschiedliche Ausgangsbedingungen zu testen. Das erste, NCI-H1975, haben Wildtyp (WT) ALK Gene, während das zweite, NCI-H3122 zeichnet sich durch ALK Translokationen. Ein ALK-gen brechen auseinander Erkennungssystem für die Fisch-Assay wurde verwendet. Das System besteht aus zwei Sonden, eine (Orange) Hybridisierung, die proximalen Bereich innerhalb von ALK auf 2p 23 und einer (grün) Hybridisierung distal zum ALK. Auf 2D unterstützt vorgesehen Immuno-DNA Fisch gut definierte Signale für Antikörper und Sonde (Abbildung 2). Insbesondere Zellinien beide zeigte klar definierte EpCAM-Membran-Lokalisierung. Darüber hinaus erschien Sonde Signale hell und scharf: NCI-H1975 Zellen zeigte überlappende orange und grüne Sonden, bestätigt den Wildtyp-Status des ALK-gen (Abbildung 2a, b). Im Gegensatz dazu zeigte NCI-H3122 Zellen überlappende Signale und einzelne grüne Punkte, was eine Löschung des ALK-gen (Abbildung 2 c, d). Wenn der Fisch Immuno-DNA Test durchgeführt wurde auf die 3D Unterstützung funktionalisierten Draht, Antikörper und Sonde Signale wurden in der Regel weniger als auf die 2D Unterstützung definiert. EpCAM Färbung zu sehen war. ALK-Sonde Signale waren weniger definiert aber noch reflektiert den erwarteten ALK-Status (Abbildung 3). Ergebnisse zeigten, dass die Immunfluoreszenz-Färbung nicht DNA Fisch Signale beeinträchtigt. Die Sonden hybridisiert speziell mit ihren Zielen. NCI-H3122-Zell-Linie zeigte einen aberranten ALK gen-Status (Abb. 3 b), im Gegensatz zu NCI-H1975, mit einem Wildtyp-ALK-gen (Abbildung 3a). Abbildung 1 : Draht, schematische Anordnung der ALK Pause auseinander Sonden, Schema der erwarteten Muster von ALK-Umlagerung und speziellen Halter funktionalisiert. (ein) rote Kästchen markieren die drei Hauptteile des Drahtes: funktionalisiert, Spitze, Draht-Stopper und UN-funktionalisierten Spitze. Die funktionalisierten Spitze ist der empfindlichste Teil des Drahtes und muss bei der Handhabung um Zelle Ablösung oder Schäden zu vermeiden nicht berührt werden. (b) die Sonden grünen und roten bzw. binden an Sequenzen vor- und nachgelagerten Loci ALK-gen (auf der linken Seite). Auf der rechten Seite erscheinen Plastiche Muster von ALK-Arrangements. Rote und grüne Co Lokalisierung Signale auf normale Zellen; getrennte grüne und rote Signale zeigen ein ALK-gen Chromosom Pause (Translokation von ALK-gen) und ein grün-Orange NS1 Signal (aberrante Zelle-1). Ein rotes Signal und zwei grüne Signale zeigen den Verlust von ein rotes Signal, was auf eine chromosomale Translokation und eine Deletion (aberrante Zelle-2). (c) Draht-Halter; rote Kästchen markieren Bereiche, wo Pflege, beim Umgang mit des Drahts während der Mikroskopie-Analyse benötigt wird. Der Draht kann eine 360° Analyse unterziehen, durch drehen den Rotator. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 2 : Immuno-DNA Fisch-Assay auf 2D Unterstützung (Deckglas). (ein, b) NCI-H1975 Zellen schwach positiv für EpCAM. EpCAM FITC Signale waren spürbar. Die Orangen und grünen Sonden des ALK Pause-apart überschnitten WT Status des ALK-gen in NCIH1975 Zelllinie bestätigen. Zellen, die Anzeige von mehr als zwei gekoppelte Signale waren aufgrund ihrer Aneuploidie. (c, d) In der hohen EpCAM exprimierenden NCIH3122-Zell-Linie waren Immunfluoreszenz Signale hell, die wurde in Zell-Zell-Verbindungen akzentuiert. Fisch Analysen bestätigten Löschungen von der ALK-gen, typisch für diese Zelllinie. Rote Pfeile zeigen einzelne grüne Sonden (ohne entsprechende orange Sonden), ALK-gen Löschung widerspiegelt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 3: Immuno-DNA Fisch assay mit funktionalisierten Draht als 3D-Unterstützung. (einem) Vertreter Bild des NCI-H1975 Zellen auf den Draht. Obwohl die 3D Form der Zellen auf dem Draht erschweren, voll unscharfe Bilder zu erwerben, ist in allen Zellen EpCAM Signal gut sichtbar. (b) Vertreter Bild von NCI-H3122 Zellen auf den Draht. ALK-Sonden zeigten gen löschen (rote Pfeile), wie zuvor auf die 2D Unterstützung gesehen. Die sichtbaren Hintergrund Signale wurden höchstwahrscheinlich aufgrund des Vorhandenseins der Polymerschicht. Jedoch es nicht erheblich beeinträchtigen, Zellanalyse Identifikation oder Fluoreszenz. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Puffer Zusammensetzung Hinweis Aktien Komplette Zellkulturmedium RPMI 1640 + 2 mM Glutamin + 5-10 % fötalem Rinderserum (FBS). RPMI: 4 ° C; Glutamin, FBS:-20 ° C Antikörper-Diluition-Puffer 1 % BSA, 0,3 % Triton x-100 mit 1 X PBS-Puffer RT. Siegel mit Labor-Film. 20 x SSC Lösung 3 M Natrium-Chlorid, 300 mM Trinatrium Citrat aufgelöst in DdH20 Filter-Lösung und pH = 7,0 +/-0,1 mit HCl RT. Siegel mit Labor-Film. 0,4 x SSC Lösung Verdünnen Sie Lager 20 X SSC in destilliertem H2O Filter-Lösung und pH = 7,0 +/-0,1 mit HCl RT.Seal mit Labor-Film. 2 x SSC + 0,05 % Tween 20 Lösung Verdünnen Sie Lager 20 x SSC in destilliertem H2O + 0,05 % Tween 20 Filter-Lösung und pH = 7,0 +/-0,1 mit HCl RT. Siegel mit Labor-Film. DAPI Lösung 30 nM Lager 1,43 µM in 1 X PBS verdünnen -20 ° C in dunklen Zustand Aliquote einsatzbereit Tabelle 1: Lösungen Rezepte.

Discussion

In diesem Papier wurde zum ersten Mal, eine Methode, die Kombination von Immunfluoreszenz-Färbung und DNA-Fisch, für den Einsatz mit dem funktionalisierten Draht vorgeschlagen. Die Methode wurde Immuno-DNA Fisch genannt. Diese Technik wurde entwickelt, erlauben die gleichzeitige Identifikation des vermeintlichen CTCs auf einem 3D Draht auf der Grundlage der phänotypischen Parameter, wie die Positivität, EpCAM (Fall 1), und die Erkennung von molekularen Veränderungen, wie z. B. ALK-gen Status (zu erleichtern Ereignis 2). Die gleichzeitige Ermittlung der beiden Ereignisse ermöglicht die Erkennung von Co Lokalisierung. Daher kann dieser Ansatz zu identifizieren und zu charakterisieren CTCs abgerufen aus dem Blut des Patienten angepasst werden. Die möglichen Auswirkungen der Universitätsklinik-Komponenten und der Leukozyten auf das Färbeverfahren stören in der Regel das Verfahren nicht. Angaben in der Literatur zufolge insbesondere Universitätsklinik-Komponenten und der Leukozyten nicht die Immunfluoreszenz Färbung der Zellen angebracht um den Draht, der entscheidende Schritt beeinflussen, tatsächliche CTCs1,15zu identifizieren.

Die Fluoreszenz-Helligkeit der Immuno-DNA Fisch ist etwas weniger ausgeprägt als der eines traditionellen Immunophototyping assay und ergibt sich aus der hohen Temperatur für den FISH-Test benötigt. Immunfluoreszenz-Färbung ist jedoch immer noch spürbar. Zum Beispiel ist ein schwaches Signal noch nachweisbar in der niedrigen EpCAM exprimierenden Zell-Linie, NCIH1975. Die hohe Temperatur erforderlich für den FISH-Test ist der wichtigste begrenzende Faktor bei der Auswahl der richtigen Fluorochrom gekoppelt an den Antikörper. In diesem Protokoll müssen Antikörper mit einer thermostabile Fluorochrom verknüpft werden, um die DNA Denaturierung Temperatur vertragen. Zum Beispiel Phycoerythrin, ein wärmeempfindliches Fluorochrom in dieser Einstellung wegen Fluorochrom Beeinträchtigung durch hohe Temperaturen empfiehlt sich nicht. Fluorescein-Herstellung ist eine gute Wahl und oft gemeinsame Fluorochrom auf Fisch-Sonden eingesetzt. Immuno-DNA Fisch Autofluoreszenz Signal ist sehr schlecht auf standard 2D unterstützt. Auf den Draht-Unterstützung kann die Polymerschicht ein leichten Autofluoreszenz-Signal, vor allem auf den Rot-Kanal induzieren. Im Gegensatz zu den 2D Hintergrund eine unspezifische Hintergrundsignal ist erkennbar am Draht aber beeinflußt nicht deutlich Kerne Identifikation oder Zelle Charakterisierung.

Mikroskop-Bewertung des Drahtes ist viel mehr als auf einem 2D Träger aufgrund der Grenzen von einem optischen Mikroskop bei der Lektüre der Oberfläche von einem zylindrisch geformten 3D-Struktur ermüdend. Jedoch kann diese Schwierigkeit überwunden werden durch drehen die Drahthalter und Importieren von Bildern, die vor allem entlang der Mittellinie des Drahtes lokalisiert sind. Die Drahthalter ermöglicht eine 360 °-Drehung des Drahtes. Nachdem auf die Kerne konzentriert, halten Senderwechsel Fluoreszenz nicht unbedingt die Fokussierung auf den Zielbereich. Aus diesem Grund ist es wesentlich, die Fokussierung auf die innere Zelle Zielbereich beizubehalten.

Diese Technik kann angepasst werden, um zu erkennen und charakterisieren Zellen auf verschiedene Arten von 3D unterstützt. Es kann auch möglich sein, verwenden Sie verschiedene Antikörper und FISH-Sonden. Bei der Wahl mit verschiedenen Antikörpern, sind Fluorochrom Thermostabilität und die Expression von das Ziel-Antigen auf der Zellmembran wichtige Faktoren zu berücksichtigen. Intra-cytoplasmatic Antigene können auch gebeizt werden. Wenn mit verschiedenen Fischen Sonden, ist es wichtig zu überprüfen, dass die Datenblatt-Spezifikationen für die Denaturierung und Zellen für die Fische vorbereiten entsprechend assay.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Materials

Ethanol Carlo Erba # 414605
Tween 20 BIO RAD # 1706531
PBS (Phosphate Buffered Saline)  Medicago # 09-9400-100
Acetone Sigma Aldrich # 534064-500ML
BSA Sigma Aldrich # A7906
Triton X-100 Detergent BIO RAD # 1610407
RUBBERCEMENT Royal Talens # 95306500
Vysis 20X SSC (66g) Abbott Molecular Inc.  # 30-804850 powder to be resuspended in distilled H2O, as recommended
RPMI 1640 Gibco # 31870-025
FBS (Fetal Bovine Serum) Gibco # 10270-098
L-Glutamine (200mM) Gibco # 25030-024
Penicillin-Streptomycin Gibco # 15140-122
H20 MilliPore
XT ALK BA MetaSystems Probes # D-6001-100-OG
DAPI, FluoroPure grade Invitrogen # D21490
SlowFade Diamond Antifade Mountant with DAPI Life Technologies # S36973
EpCAM-FITC (clone: HEA-125) Mitenyi # 130-080-301
Micro tubes M-Tube18 Gilupi Nanomedizin
Detektor CANCER01 EpCAM Gilupi Nanomedizin Functionalized wire
STAR FROST Microscope Slides Knittel GLÄSER VS1117# 076FKB
SecureSlip Silicone Supported Coverglass GRACE BIO-LABS # 104112
ZEISS Fluorescent Microscope Axioskop  ZEISS
Nikon NIS-Elements BR 4.11.00 64 bit software Nikon BR 4.11.00
Nikon DS-QiMc 12 bit digital camera Nikon DS-QiMc
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References

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Gallerani, G., Cocchi, C., Bocchini, M., Piccinini, F., Fabbri, F. Characterization of Tumor Cells Using a Medical Wire for Capturing Circulating Tumor Cells: A 3D Approach Based on Immunofluorescence and DNA FISH. J. Vis. Exp. (130), e56936, doi:10.3791/56936 (2017).
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