Summary

Handhabung und Behandlung der männlichen europäischen Aal (Anguilla Anguilla) für die hormonelle Reifung und Kryokonservierung von Spermien

Published: January 28, 2018
doi:

Summary

Protokolle für die Europäischen Aals Reifung und Sperma Kryokonservierung wurden in den letzten Jahren verbessert. Dieser Artikel beschreibt die beste Protokoll über humanes Choriongonadotropin (hCG) zur Induktion Reifung und Methanol als Kryoprotektivum verfügbar.

Abstract

In den letzten Jahren haben mehrere Forschungsgruppen an der Entwicklung und Verbesserung neuer Protokolle für den europäischen Aal Umgang und Reifung gearbeitet. Als der noch, erwiesen wöchentliche Injektionen von humanes Choriongonadotropin (hCG) sich Männchen nur 5-6 Wochen nach Behandlungsbeginn, produzieren große Mengen an qualitativ hochwertigen Spermien während mehrerer Wochen argumentativ. Darüber hinaus wurden Sperma Kryokonservierung Protokolle mit verschiedenen Extendern, Kryoprotektanten und Kühlung und Auftauen Mal zuvor für europäische Aal beschrieben. Hier zeigen wir, dass Tanaka´s Extender Lösung direkt verwendet werden kann, für die Befruchtung oder für die Kryokonservierung, wodurch erübrigt die Verwendung von verschiedenen Arten von Lösungen und Verdünnungen. Die Verwendung von Methanol als einem Kryoprotektivum macht dieses Protokoll darüber hinaus einfach zu bedienen wie Methanol hat eine geringe Toxizität und die Spermien nicht aktivieren. Das Sperma muss nicht sofort nach der Zugabe der Kryoprotektivum kryokonserviert werden, und es kann verwendet werden, lange nach aufgetaut werden. Darüber hinaus ist Beweglichkeit der Spermien nach dem Auftauen zwar geringer als die von frischem Sperma nach wie vor hoch. Das Ziel dieser Arbeit soll das verfügbare Protokoll für europäische Aal Handling, Reifung und Kryokonservierung von Spermien zeigen.

Introduction

In den letzten 25 Jahren haben die Anzahl der europäische Aal (Anguilla Anguilla) an der europäischen Küste ankommen um 90 % 1,2,3stetig abgenommen. Es gibt mehrere Faktoren, die diese drastischen einschließlich Infektionen, Verschmutzung, Überfischung und Zerstörung von Lebensräumen zu erklären. All dies hatte einen profunden Effekt auf dieser Art, führt die Einbeziehung des Europäischen Aals auf der International Union for Conservation of Nature (IUCN) Liste als kritisch gefährdet 4. Die Entwicklung der Techniken und Protokolle für die Fortpflanzung in Gefangenschaft sind daher notwendig.

Die Reifung des Europäischen Aals in Gefangenschaft wird durch hormonelle Behandlung 5,6,7 erreicht, aber die Produktion von Gameten bei beiden Geschlechtern ist schwierig, 8synchronisieren. Obwohl die Entwicklung neuer Androgen Implantate zeigt Oogenese in Aalen 9,zu beschleunigen ist10, das Timing der endgültige Reifung bei Frauen immer noch höchst variabel und schwierig zu steuern, 11. Daher sind kurzfristiger Lagerung von Samenzellen 12,13,14 und Kryokonservierung Techniken für Reproduktionsmanagement machen Gamete Synchronisation unnötige 8notwendig.

Kryokonservierung von Spermien des Europäischen Aals wurde seit 2003 15,16entwickelt. Mehrere Forscher entwickelt erfolgreiche Protokolle mit Dimethyl Sulfoxid (DMSO) oder Methanol als Kryoprotektanten 16,17,18,19,20. Obwohl beide Protokolle erfolgreich im Einsatz sind, ist die erhaltene Zellviabilität aufgetauten Spermien kryokonserviert mit DMSO geringer als bei Methanol 20,21. Darüber hinaus Aal Sperma wird bei Kontakt mit DMSO aktiviert und erfordert mehr mühsam Sperma Manipulation 19, Methanol ist daher ein geeigneter Kryoprotektivum für europäische Aal Spermien als DMSO.

Hier wird das Protokoll für optimales Handling und hormonelle Behandlung des Europäischen Aals beschrieben werden. Darüber hinaus werden auch die besten Europäischen Aals Sperma Kryokonservierung Protokoll unter Verwendung von Methanol als einem Kryoprotektivum und ein Protokoll für die Beurteilung der Qualität der Spermien in dieser Spezies beschrieben.

Protocol

Alle Verfahren für die Arbeit mit Europäischen Aals beschrieben in diesem Protokoll wurden genehmigt durch den Ausschuss der Ethik der Tier Experimente an der Universitat Politècnica de València, nach den spanischen Gesetzen und Vorschriften kontrollieren die Experimente und Verfahren an lebenden Tieren. 1. Fisch-Wartung Bringen Sie die Europäischen Aale in einer Forschungseinrichtung und steckte sie in ein 200 L-Aquarien mit einem Kreislaufsystem. Verwenden Sie Thermostate und …

Representative Results

Sperma aus 18 Aale mit einer Beweglichkeit der Spermien von 70 % oder höher, wurde für diese Studie ausgewählt. Die Ergebnisse zeigten eine Reduktion alle Qualitätsparameter nach dem Auftauen im Vergleich zu denen von frischem Sperma (Tabelle 1 und Abb. 2). Die Ergebnisse der Motilität (bedeuten ± S.E.M, n = 18) zeigten eine höhere Summe Motilität und eine progressive Motilität in frisches Sperma als die totale Motilität und progres…

Discussion

Dieses Protokoll beschreibt den gesamten Prozess für die Europäischen Aals Reifung, Handhabung und Sperma Kryokonservierung. Die hier beschriebenen Haltungsbedingungen sind optimal für schnelle Reifung und Produktion von großen Mengen von qualitativ hochwertigen Spermien in dieser Spezies 6,7,25. Der Erfolg dieses Protokolls Kryokonservierung und seine mögliche Verwendung für die Befruchtung nach dem Auftauen hängen stark…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Publikation wurde gefördert durch die Europäische Union Horizont 2020 Forschung und Innovation Programm unter der Marie Sklodowska-Curie Finanzhilfevereinbarung keine 642893 (IMPRESS), das Amt Kosten (COST Action FA 1205, AQUAGAMETE) und das Research Centre of Excellence- 1476-4/2016/FEKUT.

Materials

AQUACEN BENZOCAÍNA +D2A2:D24 AQUACEN 3394ESP Benzocaine
NaCl Avantor  3624-19
Syringe BD Plastipak 305501 Syringe 1 mL
FC500 Beckman Coulter Flow cytometer
Air pump 100 EHEIM 4011708370032 Modified for suction
Eppendorf 1.5 Eppendorf 175508 Plastic tubes 1.5 mL
Falcon tubes Falcon 175747 Plastic tubes 15 mL
Flexible bucket Fiel 1040101 40 L, Black color.
Ethanol Guinama SL Mg96270
Cyopreservation straws  IMV Technologies 14550 500 µL straws
Live/Dead Sperm Viability Kit Invitrogen L7011 Cytometer Kit
Modelling clay JOVI Art 30 4 different colors
Precision scale PCB KERN & Sohn GmbH PCB35002 Digital scale
Saline solution Vitulia 0.9% Laboratorios Ern, S.A. C.N. 999790.8 Saline solution
Forceps Levantina de Lab. SL 3710025 30 cm metal forceps
Scissors Levantina de Lab. SL 3700014 Scissors 14cm
Ovitrelle (r-hCG) Merck SL EMEA/H/C/000320 Human chorionic gonadotropin
Nikon Eclipse 80i Nikon Microscope
CaCl2 Panreac Quimica SAU 2112211210
Na2SO4 Panreac Quimica SAU 3257091611
NaHCO3 Panreac Quimica SAU 1416381210
782M Camera Proiser 782M Camera for CASA
ISAS v1 Proiser ISAS v1 CASA software
SpermTrack-10 Proiser SpermTrack-10 Countig chamber for CASA
Beaker Pyrex 3L PYREX 2110668 Glass beaker 3L
Flask Pyrex 250 GL-45 PYREX 21801365 Glass flask 250 mL
KCl Scharlab SL PO02000500
Methanol Scharlab SL ME03061000
MgCl2 Scharlab SL MA00370500
BSA Sigma Aldrich 05482 Bovine serum albumina
Styrofoam box 34x34x30 cm and 5cm thick

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Herranz-Jusdado, J. G., Kása, E., Kollár, T., Gallego, V., Peñaranda, D. S., Rozenfeld, C., Pérez, L., Horváth, Á., Asturiano, J. F. Handling and Treatment of Male European Eels (Anguilla anguilla) for Hormonal Maturation and Sperm Cryopreservation. J. Vis. Exp. (131), e56835, doi:10.3791/56835 (2018).

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