Handhabung und Behandlung der männlichen europäischen Aal (Anguilla Anguilla) für die hormonelle Reifung und Kryokonservierung von Spermien
Summary
Protokolle für die Europäischen Aals Reifung und Sperma Kryokonservierung wurden in den letzten Jahren verbessert. Dieser Artikel beschreibt die beste Protokoll über humanes Choriongonadotropin (hCG) zur Induktion Reifung und Methanol als Kryoprotektivum verfügbar.
Abstract
In den letzten Jahren haben mehrere Forschungsgruppen an der Entwicklung und Verbesserung neuer Protokolle für den europäischen Aal Umgang und Reifung gearbeitet. Als der noch, erwiesen wöchentliche Injektionen von humanes Choriongonadotropin (hCG) sich Männchen nur 5-6 Wochen nach Behandlungsbeginn, produzieren große Mengen an qualitativ hochwertigen Spermien während mehrerer Wochen argumentativ. Darüber hinaus wurden Sperma Kryokonservierung Protokolle mit verschiedenen Extendern, Kryoprotektanten und Kühlung und Auftauen Mal zuvor für europäische Aal beschrieben. Hier zeigen wir, dass Tanaka´s Extender Lösung direkt verwendet werden kann, für die Befruchtung oder für die Kryokonservierung, wodurch erübrigt die Verwendung von verschiedenen Arten von Lösungen und Verdünnungen. Die Verwendung von Methanol als einem Kryoprotektivum macht dieses Protokoll darüber hinaus einfach zu bedienen wie Methanol hat eine geringe Toxizität und die Spermien nicht aktivieren. Das Sperma muss nicht sofort nach der Zugabe der Kryoprotektivum kryokonserviert werden, und es kann verwendet werden, lange nach aufgetaut werden. Darüber hinaus ist Beweglichkeit der Spermien nach dem Auftauen zwar geringer als die von frischem Sperma nach wie vor hoch. Das Ziel dieser Arbeit soll das verfügbare Protokoll für europäische Aal Handling, Reifung und Kryokonservierung von Spermien zeigen.
Introduction
In den letzten 25 Jahren haben die Anzahl der europäische Aal (Anguilla Anguilla) an der europäischen Küste ankommen um 90 % 1,2,3stetig abgenommen. Es gibt mehrere Faktoren, die diese drastischen einschließlich Infektionen, Verschmutzung, Überfischung und Zerstörung von Lebensräumen zu erklären. All dies hatte einen profunden Effekt auf dieser Art, führt die Einbeziehung des Europäischen Aals auf der International Union for Conservation of Nature (IUCN) Liste als kritisch gefährdet 4. Die Entwicklung der Techniken und Protokolle für die Fortpflanzung in Gefangenschaft sind daher notwendig.
Die Reifung des Europäischen Aals in Gefangenschaft wird durch hormonelle Behandlung 5,6,7 erreicht, aber die Produktion von Gameten bei beiden Geschlechtern ist schwierig, 8synchronisieren. Obwohl die Entwicklung neuer Androgen Implantate zeigt Oogenese in Aalen 9,zu beschleunigen ist10, das Timing der endgültige Reifung bei Frauen immer noch höchst variabel und schwierig zu steuern, 11. Daher sind kurzfristiger Lagerung von Samenzellen 12,13,14 und Kryokonservierung Techniken für Reproduktionsmanagement machen Gamete Synchronisation unnötige 8notwendig.
Kryokonservierung von Spermien des Europäischen Aals wurde seit 2003 15,16entwickelt. Mehrere Forscher entwickelt erfolgreiche Protokolle mit Dimethyl Sulfoxid (DMSO) oder Methanol als Kryoprotektanten 16,17,18,19,20. Obwohl beide Protokolle erfolgreich im Einsatz sind, ist die erhaltene Zellviabilität aufgetauten Spermien kryokonserviert mit DMSO geringer als bei Methanol 20,21. Darüber hinaus Aal Sperma wird bei Kontakt mit DMSO aktiviert und erfordert mehr mühsam Sperma Manipulation 19, Methanol ist daher ein geeigneter Kryoprotektivum für europäische Aal Spermien als DMSO.
Hier wird das Protokoll für optimales Handling und hormonelle Behandlung des Europäischen Aals beschrieben werden. Darüber hinaus werden auch die besten Europäischen Aals Sperma Kryokonservierung Protokoll unter Verwendung von Methanol als einem Kryoprotektivum und ein Protokoll für die Beurteilung der Qualität der Spermien in dieser Spezies beschrieben.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt den gesamten Prozess für die Europäischen Aals Reifung, Handhabung und Sperma Kryokonservierung. Die hier beschriebenen Haltungsbedingungen sind optimal für schnelle Reifung und Produktion von großen Mengen von qualitativ hochwertigen Spermien in dieser Spezies 6,7,25. Der Erfolg dieses Protokolls Kryokonservierung und seine mögliche Verwendung für die Befruchtung nach dem Auftauen hängen stark…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Publikation wurde gefördert durch die Europäische Union Horizont 2020 Forschung und Innovation Programm unter der Marie Sklodowska-Curie Finanzhilfevereinbarung keine 642893 (IMPRESS), das Amt Kosten (COST Action FA 1205, AQUAGAMETE) und das Research Centre of Excellence- 1476-4/2016/FEKUT.
Materials
| AQUACEN BENZOCAÍNA +D2A2:D24 | AQUACEN | 3394ESP | Benzocaine |
| NaCl | Avantor | 3624-19 | |
| Syringe | BD Plastipak | 305501 | Syringe 1 mL |
| FC500 | Beckman Coulter | Flow cytometer | |
| Air pump 100 | EHEIM | 4011708370032 | Modified for suction |
| Eppendorf 1.5 | Eppendorf | 175508 | Plastic tubes 1.5 mL |
| Falcon tubes | Falcon | 175747 | Plastic tubes 15 mL |
| Flexible bucket | Fiel | 1040101 | 40 L, Black color. |
| Ethanol | Guinama SL | Mg96270 | |
| Cyopreservation straws | IMV Technologies | 14550 | 500 µL straws |
| Live/Dead Sperm Viability Kit | Invitrogen | L7011 | Cytometer Kit |
| Modelling clay | JOVI | Art 30 | 4 different colors |
| Precision scale PCB | KERN & Sohn GmbH | PCB35002 | Digital scale |
| Saline solution Vitulia 0.9% | Laboratorios Ern, S.A. | C.N. 999790.8 | Saline solution |
| Forceps | Levantina de Lab. SL | 3710025 | 30 cm metal forceps |
| Scissors | Levantina de Lab. SL | 3700014 | Scissors 14cm |
| Ovitrelle (r-hCG) | Merck SL | EMEA/H/C/000320 | Human chorionic gonadotropin |
| Nikon Eclipse 80i | Nikon | Microscope | |
| CaCl2 | Panreac Quimica SAU | 2112211210 | |
| Na2SO4 | Panreac Quimica SAU | 3257091611 | |
| NaHCO3 | Panreac Quimica SAU | 1416381210 | |
| 782M Camera | Proiser | 782M | Camera for CASA |
| ISAS v1 | Proiser | ISAS v1 | CASA software |
| SpermTrack-10 | Proiser | SpermTrack-10 | Countig chamber for CASA |
| Beaker Pyrex 3L | PYREX | 2110668 | Glass beaker 3L |
| Flask Pyrex 250 GL-45 | PYREX | 21801365 | Glass flask 250 mL |
| KCl | Scharlab SL | PO02000500 | |
| Methanol | Scharlab SL | ME03061000 | |
| MgCl2 | Scharlab SL | MA00370500 | |
| BSA | Sigma Aldrich | 05482 | Bovine serum albumina |
| Styrofoam box | 34x34x30 cm and 5cm thick |
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