Обработка и лечение мужского европейских угорь (Ангилья Ангилья) для гормонального созревания и криоконсервации спермы
Summary
Протоколы для созревания и спермы криоконсервация угорь улучшились за последние годы. Эта статья описывает наилучший протокол с помощью хорионического гонадотропина человека (ХГЧ) для стимулирования созревания и метанола как криопротектора.
Abstract
В последние годы работали несколько исследовательских групп по разработке и совершенствованию новых протоколов для обработки угорь и созревания. Тем не менее, по состоянию на еженедельных инъекций хорионического гонадотропина человека (ХГЧ) оказались вызревают мужчины после всего 5-6 недель лечения, производить большие объемы высокого качества спермы в течение нескольких недель. Кроме того, протоколы криоконсервирования спермы, используя различные наполнители, криопротекторов и охлаждения и оттаивания раз были ранее описаны для угорь. Здесь мы покажем, что Tanaka´s расширитель решение может непосредственно использоваться для оплодотворения или для криоконсервирования, что делает ненужным использование различных типов решений и разведения. Кроме того использование метанола как криопротектора делает этот протокол проста в использовании, как метанол имеет низкую токсичность и не активировать сперму. Спермы не нужно быть криоконсервированных сразу же после добавления криопротектора, и он может использоваться после будучи размороженным. Кроме того сперматозоидов по-прежнему высока после оттаивания, хотя это меньше, чем в свежей спермы. Цель этой работы заключается в том, чтобы показать лучшие доступные протокол для угорь обработку, созревания и криоконсервации спермы.
Introduction
За последние 25 лет количество европейских угорь (Ангилья Ангилья), прибывающие на европейском побережье неуклонно сократились на 90% 1,2,3. Существует несколько факторов, которые объясняют это резкое падение включая загрязнение, инфекции, перелова и Хабитат разрушения. Все это имеет огромное влияние на этот вид, приводит к включению угорь на Международного союза охраны природы (МСОП) списка как критические опасности 4. Следовательно необходимы развитие методов и протоколов для размножения в неволе.
Созревания угорь в плену достигается гормональное лечение 5,6,7 , но производство гамет у обоих полов очень сложно синхронизировать 8. Даже несмотря на то, что показал, что развитие новых имплантатов андрогенов ускорить женских угрей 9,10, сроков окончательного созревания самок по-прежнему высоко переменная и трудно контролировать 11. Таким образом кратковременного хранения спермы 12,13,14 и криоконсервацию методы необходимы для воспроизводства управления, что делает гамет синхронизацию ненужных 8.
Криоконсервация спермы угорь был разработан с 2003 года 15,16. Несколько исследователей разработан успешных протоколы, используя диметилсульфоксида (ДМСО) или метанола как криопротекторы 16,,1718,19,20. Хотя оба протокола были успешно использованы, полученные клетки жизнеспособность талой сперму замораживают с ДМСО ниже, чем с метанолом в 20,21. Кроме того угорь спермы активируется на контакт с ДМСО и требует более утомительным спермы манипуляции 19, поэтому метанола является более подходящим криопротектора для спермы угорь чем ДМСО.
Здесь протокол для оптимальной обработки и гормонального лечения угорь будут описаны ниже. Помимо этого лучший европейский угорь спермы криоконсервация протокол с использованием метанола как криопротектора и протокол для оценки качества спермы в этот вид также будет описано.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол описывает полный процесс созревания, обработку и спермы криоконсервация угорь. Описанные здесь условия животноводства являются оптимальными для быстрого созревания и производства больших объемов спермы высокого качества в этом видов 6,7<s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта публикация была финансируется Европейского союза Horizon 2020 исследований и инновационной программы под Марии Склодовской-Кюри грантовое соглашение не 642893 (Импрес), Канцелярия стоимость (стоимость действий FA 1205, AQUAGAMETE) и центр передовых научных исследований- 1476-4/2016/FEKUT.
Materials
| AQUACEN BENZOCAÍNA +D2A2:D24 | AQUACEN | 3394ESP | Benzocaine |
| NaCl | Avantor | 3624-19 | |
| Syringe | BD Plastipak | 305501 | Syringe 1 mL |
| FC500 | Beckman Coulter | Flow cytometer | |
| Air pump 100 | EHEIM | 4011708370032 | Modified for suction |
| Eppendorf 1.5 | Eppendorf | 175508 | Plastic tubes 1.5 mL |
| Falcon tubes | Falcon | 175747 | Plastic tubes 15 mL |
| Flexible bucket | Fiel | 1040101 | 40 L, Black color. |
| Ethanol | Guinama SL | Mg96270 | |
| Cyopreservation straws | IMV Technologies | 14550 | 500 µL straws |
| Live/Dead Sperm Viability Kit | Invitrogen | L7011 | Cytometer Kit |
| Modelling clay | JOVI | Art 30 | 4 different colors |
| Precision scale PCB | KERN & Sohn GmbH | PCB35002 | Digital scale |
| Saline solution Vitulia 0.9% | Laboratorios Ern, S.A. | C.N. 999790.8 | Saline solution |
| Forceps | Levantina de Lab. SL | 3710025 | 30 cm metal forceps |
| Scissors | Levantina de Lab. SL | 3700014 | Scissors 14cm |
| Ovitrelle (r-hCG) | Merck SL | EMEA/H/C/000320 | Human chorionic gonadotropin |
| Nikon Eclipse 80i | Nikon | Microscope | |
| CaCl2 | Panreac Quimica SAU | 2112211210 | |
| Na2SO4 | Panreac Quimica SAU | 3257091611 | |
| NaHCO3 | Panreac Quimica SAU | 1416381210 | |
| 782M Camera | Proiser | 782M | Camera for CASA |
| ISAS v1 | Proiser | ISAS v1 | CASA software |
| SpermTrack-10 | Proiser | SpermTrack-10 | Countig chamber for CASA |
| Beaker Pyrex 3L | PYREX | 2110668 | Glass beaker 3L |
| Flask Pyrex 250 GL-45 | PYREX | 21801365 | Glass flask 250 mL |
| KCl | Scharlab SL | PO02000500 | |
| Methanol | Scharlab SL | ME03061000 | |
| MgCl2 | Scharlab SL | MA00370500 | |
| BSA | Sigma Aldrich | 05482 | Bovine serum albumina |
| Styrofoam box | 34x34x30 cm and 5cm thick |
References
- ICES_Working_Group_on_Eels. . Report of the 2011 Session of the Joint EIFAAC/ICES Working Group on Eels. , 246 (2011).
- Moriarty, C. European Catches of Elver of 1928-1988. Int. Rev. Hydrobiol. 75 (6), 701-706 (1990).
- Dekker, W. The fractal geometry of the European eel stock. ICES J. Mar. Sci. 57 (1), 109-121 (2000).
- Jacoby, D., Gollock, M. . Anguilla anguilla. The IUCN red list of threatened species. Version 2014.2. , (2014).
- Asturiano, J. F., et al. Effects of hCG as spermiation inducer on European eel semen quality. Theriogenology. 66 (4), 1012-1020 (2006).
- Pérez, L., et al. Induction of maturation and spermiation in the male European eel: assessment of sperm quality throughout treatment. J. Fish Biol. 57 (6), 1488-1504 (2000).
- Gallego, V., et al. Study of the effects of thermal regime and alternative hormonal treatments on the reproductive performance of European eel males (Anguilla anguilla) during induced sexual maturation. Aquaculture. 354, 7-16 (2012).
- Asturiano, J. F., Sørensen, S. R., Pérez, L., Lauesen, P., Tomkiewicz, J. First Production of Larvae Using Cryopreserved Sperm: Effects of Preservation Temperature and Cryopreservation on European Eel Sperm Fertilization Capacity. Reprod. Domestic Anim. 51 (4), 485-491 (2016).
- Di Biase, A., et al. Co-treatment with androgens during artificial induction of maturation in female eel, Anguilla anguilla: Effects on egg production and early development. Aquaculture. 479, 508-515 (2017).
- Lokman, P., Wylie, M. J., Downes, M., Di Biase, A., Damsteegt, E. L. Artificial induction of maturation in female silver eels, Anguilla australis: The benefits of androgen pre-treatment. Aquaculture. 437, 111-119 (2015).
- Mylonas, C. C., Duncan, N. J., Asturiano, J. F. Hormonal manipulations for the enhancement of sperm production in cultured fish and evaluation of sperm quality. Aquaculture. , (2016).
- Ohta, H., Izawa, T. Diluent for cool storage of the Japanese eel (Anguilla japonica) spermatozoa. Aquaculture. 142 (1-2), 107-118 (1996).
- Peñaranda, D. S., et al. European Eel Sperm Diluent for Short-term Storage. Reprod. Domestic Anim. 45 (3), 407-415 (2010).
- Ohta, H., Kagawa, H., Tanaka, H., Unuma, T. Control by the environmental concentration of ions of the potential for motility in Japanese eel spermatozoa. Aquaculture. 198 (3), 339-351 (2001).
- Asturiano, J., et al. Media and methods for the cryopreservation of European eel (Anguilla anguilla) sperm. Fish Physiol. Biochem. 28 (1), 501-502 (2003).
- Asturiano, J., et al. Physio-chemical characteristics of seminal plasma and development of media and methods for the cryopreservation of European eel sperm. Fish Physiol. Biochem. 30 (3), 283-293 (2004).
- Szabó, G., et al. Cryopreservation of European eel (Anguilla anguilla) sperm using different extenders and cryoprotectants. Acta. Biol. Hung. 56 (1-2), 173-175 (2005).
- Müller, T., et al. Cryopreservation of sperm of farmed European eel Anguilla anguilla. J World Aquac Soc. 35 (2), 225-231 (2004).
- Peñaranda, D. S., Pérez, L., Gallego, V., Jover, M., Asturiano, J. F. Improvement of European eel sperm cryopreservation method by preventing spermatozoa movement activation caused by cryoprotectants. Cryobiology. 59 (2), 119-126 (2009).
- Marco-Jiménez, F., et al. Cryopreservation of European eel (Anguilla anguilla) spermatozoa: effect of dilution ratio, foetal bovine serum supplementation, and cryoprotectants. Cryobiology. 53 (1), 51-57 (2006).
- Asturiano, J. F., et al. Effect of sperm cryopreservation on the European eel sperm viability and spermatozoa morphology. Reprod. Domestic Anim. 42 (2), 162-166 (2007).
- Mordenti, M., Di Biase, A., Sirri, R., Modugno, S., Tasselli, A. Induction of Sexual Maturation in Wild Female European Eels (Anguilla anguilla) in Darkness and Light. Isr. J. Aquac. 64, (2012).
- Ohta, H., et al. Artificial induction of maturation and fertilization in the Japanese eel, Anguilla japonica. Fish Physiol. Biochem. 17 (1), 163-169 (1997).
- Tanaka, S., et al. Long-term cryopreservation of sperm of Japanese eel. J. Fish Biol. 60 (1), 139-146 (2002).
- Gallego, V., et al. Subpopulation pattern of eel spermatozoa is affected by post-activation time, hormonal treatment and the thermal regimen. Reprod. Fertil. Dev. 27 (3), 529-543 (2015).
- Asturiano, J. F., Cabrita, E., Horváth, &. #. 1. 9. 3. ;. Progress, challenges and perspectives on fish gamete cryopreservation: A mini-review. Gen. Comp. Endocrinol. , (2016).
- Kime, D. E., et al. Computer-assisted sperm analysis (CASA) as a tool for monitoring sperm quality in fish. Comp. Biochem. Physiol. C Toxicol. Pharmacol. 130 (4), 425-433 (2001).
- Rurangwa, E., Kime, D. E., Ollevier, F., Nash, J. P. The measurement of sperm motility and factors affecting sperm quality in cultured fish. Aquaculture. 234 (1-4), 1-28 (2004).
- Verstegen, J., Iguer-Ouada, M., Onclin, K. Computer assisted semen analyzers in andrology research and veterinary practice. Theriogenology. 57 (1), 149-179 (2002).
- Magnotti, C., et al. Cryopreservation and vitrification of fish semen: a review with special emphasis on marine species. Rev. Aquacult. , (2016).
- Dziewulska, K., Rzemieniecki, A., Czerniawski, R., Domagała, J. Post-thawed motility and fertility from Atlantic salmon (Salmo salar L.) sperm frozen with four cryodiluents in straws or pellets. Theriogenology. 76 (2), 300-311 (2011).
- Babiak, I., Bolla, S., Ottesen, O. Suitable methods for cryopreservation of semen from Atlantic halibut, Hippoglossus hippoglossus L. Aquac. Int. 16 (6), 561-572 (2008).
- Müller, T., et al. Japanese eel (Anguilla japonica Temminck & Schlegel, 1846) propagation using cryopreserved sperm samples. J. Appl. Ichthyol. 33 (3), 550-552 (2017).
