Summary

Proyección de imagen de calcio de dos fotones en las dendritas neuronales en rebanadas de cerebro

Published: March 15, 2018
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Summary

Se presenta un método que combina grabaciones de celulares-abrazadera del remiendo y la proyección de la imagen de dos fotones para registrar a transitorios de Ca2 + en las dendritas neuronales en rebanadas de cerebro agudo.

Abstract

Proyección de imagen de calcio (Ca2 +) es una herramienta poderosa para investigar la dinámica espacio-temporal de Ca2 + señales intracelulares en las dendritas neuronales. CA2 + las fluctuaciones pueden ocurrir a través de una variedad de membranas y mecanismos intracelulares y juega un papel crucial en la inducción de la plasticidad sináptica y la regulación de la excitabilidad dendrítica. Por lo tanto, la capacidad para registrar diferentes tipos de señales de Ca2 + en ramas dendríticas es valiosa para estudiar cómo las dendritas integran información de grupos. El advenimiento de la microscopía de dos fotones ha facilitado este tipo de estudios significativamente mediante la solución de los problemas inherentes a la proyección de imagen en tejido vivo, como la dispersión de la luz y fotodaño. Además, a través de la combinación de técnicas electrofisiológicas convencionales con dos fotones Ca2 + proyección de imagen, es posible investigar local Ca2 + las fluctuaciones en las dendritas neuronales en forma paralela a las grabaciones de la actividad sináptica en Soma. Aquí, describimos cómo utilizar este método para estudiar la dinámica de local Ca2 + transitorios (gatos) en las dendritas de las interneuronas inhibitorias GABAérgicas. El método puede ser aplicado también al estudio de dendríticas Ca2 + en diferentes tipos neuronales en rebanadas de cerebro agudo.

Introduction

La contribución de una neurona a la actividad de la red está determinada por la naturaleza dinámica de las entradas sinápticas que recibe. Tradicionalmente, el método predominante de caracterizar la actividad sináptica en las neuronas dependía de grabaciones somáticas celulares-abrazadera del remiendo de corrientes postsynaptic evocadas por la estimulación eléctrica de los axones de paso. Sin embargo, única actividad de la sinapsis situada proximally se divulga con la verdad en este caso1. Además, para evaluar los mecanismos específicos de la sinapsis, se han utilizado grabaciones de pares de neuronas y dendritas en un lugar específico a las sinapsis de interés y los mecanismos de integración dendrítica, respectivamente. Se logró un gran avance en el campo de la Fisiología sináptica a través de una combinación de técnicas ópticas y electrofisiológicas. Láser de excitación de dos fotones microscopía (2PLSM) en combinación con herramientas de optogenetic y Ca2 + la proyección de imagen puede revelar grandes detalles de la organización dinámica de la actividad sináptica en las conexiones neuronales específicas en rebanadas de cerebro en Vitro e in vivo.

Varias ventajas claves hecho 2PLSM sobresalen la excitación convencional, un fotón microscopia2: (1) debido al carácter no lineal de excitación de dos fotones, la fluorescencia se genera solamente en el volumen focal, y representan todos los fotones emitidos señales útiles (sin necesidad de agujero de alfiler); (2) más de largo longitudes de onda, utilizados en 2PLSM, penetran en el tejido de dispersión más eficiente; Además, los fotones dispersos son demasiado diluidos para producir la excitación de dos fotones y la fluorescencia del fondo; (3) fotoenvejecimiento y fototoxicidad también se limitan al plano focal. Por lo tanto, a pesar del alto costo de los sistemas 2-fotón en comparación con los microscopios confocales convencionales, la 2PLSM sigue siendo un método de elección para la investigación de alta resolución de la estructura neuronal y función en tejido grueso vivo.

El primer uso de 2PLSM en el tejido de dispersión fue la imagen de la estructura y función de espinas dendríticas3. 2PLSM en combinación con Ca2 + la proyección de imagen ha revelado esa función de espinas como compartimientos bioquímicos aislados. Ya que en muchos tipos neuronales existe una correspondencia biunívoca entre espinas y las sinapsis individuales4, dos fotones Ca2 + imagen pronto se convirtió en una útil herramienta de reporting de la actividad de las sinapsis individuales en el tejido intacto5, 6,7,8. Además, basado en la 2PLSM Ca2 + proyección de imagen fue utilizado con éxito para supervisar la actividad de los canales de calcio solo y las interacciones no lineales entre las conductancias intrínsecas y sinápticas, así como para evaluar el estado y actividad dependiente regulación de Ca2 + en las dendritas neuronales5,6,7,8,9,10,11.

El calcio es un segundo mensajero intracelular ubicuo y su organización espacio-temporal subcelular determina la dirección de las reacciones fisiológicas, de los cambios en fuerza sináptica a la regulación de iones canales, crecimiento de la dendrita y la columna vertebral, como así como la muerte celular y la supervivencia. Dendríticas Ca2 + elevaciones se producen mediante la activación de múltiples vías. Potenciales de acción (APs), backpropagating a las dendritas, abre voltaje-bloqueado calcio canales12 y producir a relativamente global Ca2 + transitorios (gatos) en las dendritas y espinas13. Transmisión sináptica se asocia con la activación de postsynaptic Ca2 +-permeables receptores (NMDA, Ca2 +-permeable al AMPA y kainato), activación sináptica gatos de14,6,15. Por último, pueden generarse supralinear Ca2 + eventos en dendritas bajo ciertas condiciones11,12,13,16.

Emplea dos fotones Ca2 + proyección de imagen en combinación con las grabaciones electrofisiológicas abrazadera del remiendo sintético Ca2 +-indicadores fluorescentes sensibles, que por lo general se entregan a través de los electrodos de parche durante grabaciones de celulares . Un método estándar para la cuantificación de la dinámica de Ca2 + se basa en el método de doble indicador17,18. Utiliza dos fluoróforos con espectros de emisión bien separados (p. ej., una combinación de un rojo Ca2 +-insensible tinta verde Ca2 + indicadores, tales como verde de Oregon BAPTA-1 o Fluo-4) y tiene varias ventajas en comparación con el método de indicador único. Primero, una Ca2 +-insensible tinte se utiliza para localizar pequeñas estructuras de interés (ramas dendríticos y espinas) donde se realizará la proyección de imagen de Ca2 + . En segundo lugar, la relación entre el cambio en la fluorescencia verde y rojo (ΔG/R) se calcula como una medida de la [Ca2 +], que es en gran parte insensible a los cambios en la fluorescencia basal debido a fluctuaciones en la [Ca2 +]017 , 18. por otra parte, cambios de fluorescencia pueden ser calibradas en términos de absoluta Ca2 + concentraciones19.

Una preocupación general cuando dos fotones Ca2 + de los experimentos en rebanadas agudos es celular salud y estabilidad de la adquisición de la imagen debido a la potencia del láser alta que normalmente se utiliza. Además, en experimentos de Ca2 + proyección de imagen, hay preocupación por la perturbación y considerable sobreestimación de subcelular Ca2 + dinámica debido a que los indicadores de Ca2 + actúan como móvil altamente exógeno Ca2 + almacenadores intermediarios. Por lo tanto, la elección del indicador de Ca2 + y su concentración depende del tipo neuronal, la amplitud esperada de gatos y de la pregunta experimental.

Adaptamos el método de dos fotones Ca2 + proyección de imagen para investigación de Ca2 + las fluctuaciones en las dendritas de GABAérgico interneuronas9,10,11,20,21 , 22. mientras que la mayor parte de los primeros Ca2 + imagen estudios se realizaron en las principales neuronas, inhibitorios interneurons mostrar una gran variedad de funciones Ca2 + mecanismos que son distintas a las de las células piramidales20 , 23 , 24. estos mecanismos específicos de interneurona (p. ej., Ca2 + permeable AMPA receptores) pueden desempeñar papeles específicos en la regulación de la actividad de la célula. Dendríticas Ca2 + en interneuronas es un objetivo tentador para la posterior investigación, dos fotones Ca2 + en las dendritas de estas células presenta desafíos adicionales, de un diámetro más fino de las dendritas y la falta de espinas para una particularmente alta Ca2 + vinculante capacidad endógena. Como nuestra investigación intereses se centran en el estudio de interneurons hippocampal, el siguiente protocolo, si bien aplicable a distintas poblaciones neuronales, fue adaptado para hacer frente a esos desafíos.

Este protocolo fue ejecutado con un microscopio confocal comercial de dos fotones, que fue equipado con dos detectores externos, no descanned (NDDs), modulador electro-óptico (MOE) y un Dodt exploración contraste degradado (SGC) e instalado sobre una mesa óptica. El microscopio fue juntado con un láser de TI: zafiro multifotón modo-bloqueado a 800 nm (> 3 W 140 pulsos de fs, tasa de repetición de 80 Hz). El sistema de proyección de imagen fue equipado con una plataforma de electrofisiología estándar, incluyendo una cámara de perfusión con control de temperatura, una plataforma de traducción con dos micromanipuladores, un amplificador controlado por ordenador del microelectrodo, un digitalizador, un estímulo unidad y software de adquisición de datos.

Protocol

Todos los experimentos fueron realizados siguiendo las directrices de bienestar animal de la Comisión de protección Animal de Université Laval y el Consejo Canadiense sobre el cuidado Animal. 1. preliminar preparación (opcional: preparar 1 día de anticipación) Preparar tres tipos de solución de líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF) (Normal, sacarosa y soluciones de recuperación, 1 L cada; ver tabla 1). Ajustar la osmolalidad de las soluciones a 300 ± 1…

Representative Results

Utilizando el protocolo presentado aquí, obtuvimos gatos evocados por inyección actual somática y por estimulación eléctrica en las dendritas de las interneuronas oriens/alveus en el área CA1 del hipocampo. Después de remendar una neurona, identificada en su forma y posición base, hemos adquirido el linescans a través de una dendrita proximal en varios puntos en el dado Distancias desde el soma (figura 1A). Se observó una disminución en la amplitud…

Discussion

El método que se muestra a continuación muestra cómo la combinación de dos fotones Ca2 + proyección de imagen y electrofisiología patch-clamp se puede utilizar para estudiar dendríticas Ca2 + en las dendritas neuronales en rebanadas de cerebro agudo. Este método permite el control de ambos el local Ca2 + elevaciones evocadas por AP eléctrico de estimulación o backpropagating en segmentos dendríticos y la respuesta somática de la célula. Esta es una excelente herramienta para …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por el Consejo de institutos canadienses de investigación en salud, las ciencias naturales y la investigación en Ingeniería (NSERC Discovery Grant) y la Fundación de Saboya. OC fue apoyado por una beca de doctorado de NSERC.

Materials

Animal Strain: Mouse CD1  Charles River 022
Isoflurane AbbVie Corporation 0B506-099
CGP 55845 hydrochloride  Abcam ab120337
Calcium chloride  Sigma-Aldrich C4901
D-(+)-Glucose  Sigma-Aldrich G8270
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Magnesium chloride  Sigma-Aldrich M8266
Magnesium sulfate heptahydrate Sigma-Aldrich 230391
Paraformaldehyde powder, 95% Sigma-Aldrich 158127
Potassium chloride  Sigma-Aldrich P3911
Potassium gluconate  Sigma-Aldrich P1847
Sodium azide  Sigma-Aldrich S2002
Sodium bicarbonate  Sigma-Aldrich S8875
Sodium chloride  Sigma-Aldrich S5886
Sucrose  Sigma-Aldrich S9378
Triton X-100  Sigma-Aldrich T9284
Trizma base  Sigma-Aldrich T1503
Trizma hydrochloride  Sigma-Aldrich T3253
Sodium phosphate dibasic dihydrate  Sigma-Aldrich 71643

Sodium phosphate monobasic
monohydrate 
Sigma-Aldrich S9638
Biocytin Sigma-Aldrich B4261
Alexa Fluor 594 Hydrazide ThermoFisher Scientific A10438
SR95531 (Gabazine)  Abcam ab120042

Adenosine triphosphate (ATP)-Tris
Sigma-Aldrich A9062

Guanosine (GTP)-Na+
Sigma-Aldrich G8877

Oregon Green BAPTA-1
ThermoFisher Scientific O6812

Phosphocreatine di(tris) salt
Sigma-Aldrich P1937

Streptavidin-conjugated Alexa-546
ThermoFisher Scientific S11225

Patch Borosilicate Glass Capillaries
World Precision Instruments 1B100F-4

Theta Borosilicate Glass Capillaries
Sutter Instrument BT-150-10

P-97 Flaming/Brown Micropipette puller
Sutter Instrument

TCS SP5 Confocal Multiphoton Microscope
Leica Microsystems

Chameleon Ultra II Ti:Sapphire multiphoton laser 
Coherent
LAS AF Imaging Acquisition Software Leica Microsystems

Temperature Controller TC-324B
Warner Instruments

MultiClamp 700B Amplifier
Molecular Devices

Digidata 1440A Digitizer
Molecular Devices

Confocal Translator
Siskiyou

Micromanipulator
Siskiyou

pClamp Data Acquisition Software
Molecular Devices

A365 Constant Current Stimulus Isolator
World Precision Instruments

Vibraplane Optical Table
Kinetic Systems

References

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Cite This Article
Camiré, O., Topolnik, L. Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices. J. Vis. Exp. (133), e56776, doi:10.3791/56776 (2018).

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