Síntese de funcionalizados 10 nm polímero-revestida com partículas de ouro para o direcionamento do endotélio e entrega da droga

1. preparação ou aquisição de soluções estoque (para ser armazenado em temperatura ambiente ou congelados até o uso) Prepare uma solução estoque de hidróxido de sódio (NaOH) 1M, dissolvendo-se 400 mg de NaOH em 10 mL de água ultrapura em temperatura ambiente e misturar os materiais bem.Nota: Água ultrapura é definida como a água sem impurezas tais como partículas, bactérias, nucleases, íons ou vestígios de orgânicos. Um sistema de purificação é usado para obter a água ultrapura, resultando em sua resistividade de até 18,2 mΩ·cm, indicando uma baixa contaminação aniônica. Não se recomenda o uso de garrafas de água ultrapura comercialmente disponível. De agora em diante, esta água ultrapura será referida como a água, a menos que especificado de outra forma. Preparar uma solução de NaOH de 6m, dissolvendo a 2,4 g de NaOH em 10 mL de água e armazenar a solução à temperatura ambiente. Prepare uma solução stock de 250 mM de Ácido cloroáurico (HAuCl4), dissolvendo 1 g de secas HAuCl4 em 10,16 mL de água. Dilua 1 mL de HAuCl4 de 250 mM com 9 mL de água para obter a concentração de trabalho de 25 mM HAuCl4. Armazene a solução de4 HAuCl à temperatura ambiente. Prepare um buffer de carbonato de 0,1 M em pH 8.8, dissolvendo 84 mg de bicarbonato de sódio em 10 mL de água e ajustar o pH a 8,8 adicionando 6 M NaOH da etapa 1.2. Armazene o buffer de carbonato na temperatura de quarto. Misturar 20 mL de tetrazólio sal composto, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium (MTS), com um agente de estabilização, ethosulfate Fenazina (PES) (ver Tabela de materiais). Armazene a mistura MTS/PES em alíquotas (para um máximo de 10 ciclos de congelamento e descongelamento) a-20 ° C, no escuro. 2. síntese dos núcleos nanopartículas de ouro Preparar uma solução diluída de THPC adicionando 12 µ l de 80% THPC na água a 1 mL de água em um tubo de microcentrifugadora à temperatura ambiente. Fixe um balão de fundo redondo de 100 mL sobre o centro de uma placa de agitação magnética. Despeje o frasco com 45 mL de água e misture a água com 300 rpm usando uma barra pequena agitação magnética em forma de ovo. Adicione 0,5 mL de NaOH de M 1 e 1 mL de solução diluída de THPC. Continue a agitar a mistura vigorosamente por 5 min. Continue mexendo a mistura e adicionar 2 mL de solução de4 HAuCl de 25 mM. Mudará a cor da mistura do amarelo ao marrom escuro dentro de segundos, indicando que a formação de THPC tampado AuNPs com uma carga negativa. Agite a mistura para um 15min adicional permitir a formação completa dos núcleos ouro. 3. adição de polímero Corona em torno as nanopartículas de ouro Durante o período de 15 min descrito na etapa 2.3, preparar o PEG soluções dissolvendo-se cada uma das seguintes em 1 mL de água em frascos de vidro de 4 mL: 30 mg NH2-PEG-SH; 7,5 mg m-PEG-SH; 7,5 mg COOH-PEG-SH.Nota: As concentrações resultantes devem ser de 8,8 M NH2-PEG-SH, 3,75 M m-PEG-SH e 3.75 M COOH-PEG-SH. Depois de reduzir a velocidade de agita da solução num balão de fundo redondo de 100 rpm, adicionar o PEG soluções para a solução de THPC tampado AuNPs gota a gota. Continue a agitar a mistura suavemente durante a noite, à temperatura ambiente, para assegurar a remoção eficiente de THPC e a substituição por PEG. Para o próximo 72 h, use uma membrana de celulose corte de peso molecular de kDa 12-14 para urinar a mistura mexida contra um balde de 4 L de água agitada a 60 rpm. Amarre as pontas das membranas por clipes de diálise e transferir a solução através de uma pipeta.Nota: Este processo de diálise com 12-14 kDa membrana corte remove apenas PEG não tenha reagida, THPC e outros reagentes químicos, por difusão ao longo de um gradiente de concentração. Para manter o alto gradiente de concentração e promover a difusão contínua, trocar a água cada 2 h para as primeiras 6 horas e a cada 6-12 h para a restante 66 h.Nota: O objetivo desta água alterar agendamento é acomodar a difusão rápida que ocorre logo no início, por causa da concentração elevada inicialmente dentro da amostra. O processo de diálise descrito acima folhas a solução de nanopartículas semi purificada, porque as nanopartículas, precipitados, agregados e outras impurezas de tamanho grande, não podem passar através dos poros da membrana corte kDa 12-14. Filtre a solução de nanopartículas semi purificada em um tubo cónico de 50mL, usando um filtro de seringa 0,2 µm para remover os restantes precipitados, agregados e outras impurezas de tamanho grande. Coloque o tubo cônico em um freezer-80 ° C e permitir que a solução de PEGylated AuNP (PEG-AuNP) purificada congelar cerca de 5h. Use um secador de gelo para lyophilize o PEG-AuNP purificado. Armazene o PEG-AuNP seco, purificado a 4 ° C até o uso. 4. conjugação Fluorophores usando N-Hidroxisuccinimida (NHS) éster para os NH2 grupos sobre o PEG-AuNP Fixe um balão de fundo redondo de 50 mL sobre o centro de uma placa de agitação magnética. Encher o frasco com 18 mL de água e misture a água a 100 rpm usando uma barra de agitação magnética em forma de ovo. Pese 2 mg do PEG-AuNP liofilizado em um tubo cônico de 4 mL, usando uma escala de bancada de alta precisão. Use uma arma antiestática para eliminar a carga estática e o apego do PEG-AuNP pó na superfície do tubo. Adicione 2 mL de água para o tubo. Despeje a 2 mL de solução de PEG-AuNP o balão de fundo redondo para reconstituição em um total de 20 mL de água. Continue a agitar a mistura a 100 rpm usando uma barra de agitação magnética em forma de ovo. Adicionar 1 mL de 0,1 M, pH 8.8 carbonato de buffer para o 20 mL de leite reconstituído AuNP contido no balão de fundo redondo. Continue mexendo. Adicione 5 µ l de éster de NHS fluorescente 10 mg/mL em dimetilsulfóxido.Nota: Qualquer tintura fluorescente pode ser usada neste processo. Misture o PEG fluorescente durante a noite. Mantê-lo em temperatura ambiente e coberto com papel de alumínio. Para o próximo 72 h, remova excesso fluorophores usando o protocolo descrito na etapa 3.3. Brevemente, Dialize mexida mistura usando um balde de 4 L de água e uma membrana de celulose corte de peso molecular de kDa 12-14. Trocar a água a cada 2h para os primeiros 6 h e cada 6-12 h para a restante 66 h. Obter 1 mL a solução PEG-AuNP fluorescente purificada, deve ser usado para caracterização descrita abaixo na seção 5. Congelar e lyophilize o restante da solução para obter nanopartículas fluorescentes em forma de pó para armazenamento a 4 ° C, conforme descrito nas etapas 3.5-3.7. Use um filtro de seringa 0,2 µm para esterilizar e remover qualquer potenciais precipitados uma vez reconstituídos para aplicações de cultura de células. 5. caracterização de nanopartículas fluorescentes peguilado ouro Usando microscopia eletrônica de transmissão (TEM) para visualizar o núcleo de nanopartículas de ouro e quantificar os tamanhos Queda de 10 µ l da solução fluorescente PEG-AuNP purificada em uma grade TEM malha de carbono revestido. Depois de 5 min, use um pedaço de papel de filtro para pavio cuidadosamente o excesso de líquido fora da borda da grade TEM até um filme contendo o fluorescente que Peg-AuNPs é deixado para trás. Ver o PEG-AuNPs fluorescente em 80 kV e uma ampliação de 50.000-150, 000. Tire fotos digitais.Nota: Apenas o núcleo de ouro será visível porque o PEG não é denso sobre a temperatura do elétron. Usando um software de medição, definir a escala de medição em correlação com a barra de escala. Calcular os diâmetros de aproximadamente 20 núcleos de ouro e em seguida, determinar o diâmetro de núcleo ouro média.Nota: O sistema de imagens TEM automaticamente coloca uma barra de escala nas fotos digitais. Medição de tamanho de nanopartículas hidrodinâmico usando Difusão dinâmica da luz (DLS) Transferi 1 mg de liofilizado AuNPs THPC-revestido em um tubo de microcentrifugadora usando a abordagem descrita na etapa 4.2. Transferi 1 mg de liofilizado PEG-AuNP num tubo separado. Adicionar 1 mL de água a cada tubo e transferir cada solução AuNP a um plástico transparente de 1 mL. Coloque uma cubeta num instrumento DLS e medir diâmetros hidrodinâmicos esféricos, usando o software de analisador de partícula que é incorporado ao sistema DLS. Traça os diâmetros hidrodinâmicos medidos usando um formato de histograma.Nota: O histograma agrupará nanopartículas por tamanho. O maior grupo de nanopartículas esclarecerá o diâmetro que melhor descreve o tamanho da AuNPs sintetizado neste protocolo. Confirmação de fluorescência fluorométricaNota: A mesma amostra e cubeta da etapa 5.2 podem ser usados para medir o sinal fluorescente. Remova o DLS a cubeta e inserir um spectrofluorometer. Conjunto o comprimento de onda de excitação a 633 nm e ler a fluorescência emitida sinais ao longo de uma faixa de comprimento de onda de 650-800 nm. Confirmar que o pico é aproximadamente 665 nm, que se correlaciona com o pico de emissão para NHS.Nota: Ajuste os excitação e emissão de comprimentos de onda de acordo com o fluoróforo usado no processo. 11 para avaliar a biocompatibilidade de ensaios MTS Numa cultura clara de 96 poços de fundo de tecido estéril tratada placa, Pipetar 100 µ l de meio modificado águia de Dulbecco (DMEM; suplementado com 10% fetal bovino soro e 1% penicilina/estreptomicina) e 3.2 x 103 células em cada poço.Nota: Neste estudo, as células endoteliais de rato do tecido são usadas. Um total de 21 poços são usados para permitir 3 repetições para cada uma das 7 concentrações diferentes de nanopartículas (ver passo 5.4.3 para concentrações específicas de interesse). Permitir que as células a crescer a confluência na umidade e 5% CO2 controlada incubadoras em 37 ° C11. Prepare tubos microcentrifuga individuais, cada um contendo 300 µ l de DMEM com nanopartículas de várias concentrações. Este estudo requer 7 diferentes tubos de DMEM com as seguintes concentrações de PEG-AuNP: 0 µ g/mL, 10 µ g/mL, 50 µ g/mL, 100 mg/mL, 250 µ g/mL, 500 µ g/mL e 1.000 µ g/mL. Aspire o DMEM do tubo. Encha os poços em triplicado com 100 µ l de mídia DMEM contendo 0, 10, 50, 100, 250, 500 ou 1.000 µ g/mL de AuNP. Permitir que as células e nanopartículas de co incubar durante um período pré-determinado de tempo, aqui por 16 h. Perto do final do período de incubação, descongele mistura da etapa 1,5 MTS/PES. Após a incubação, Aspire o DMEM e as nanopartículas suspensas, vagamente anexadas dos poços. Adicione 100 µ l de DMEM fresco juntamente com 20 µ l de solução MTS/PES para obter 1:5 MTS/PES para relação DMEM de acordo com o protocolo do fabricante. Incube as celulas com MTS/PES a 37 ° C por 2 h.Nota: Este tempo de incubação de 2 h é determinado pela atividade metabólica das células endoteliais e pode ser aumentado para até 4 h para outros tipos de células. No prazo de 2 h, a MTS é metabolizada pelas células endoteliais na colorida formazan que mistura com o DMEM. A probabilidade de viabilidade celular e biocompatibilidade do PEG-AuNP serão demonstradas com formazan mais colorida. Toxicidade do PEG-AuNP e a chance de que as células estão morrendo aparece com uma cor menos intensa. Executar análise colorimétrica de cada poço por leitura de absorvância a 492 nm com um leitor de placas compatíveis. Para cada concentração de nanopartículas, calcule a absorbância média a valores de absorvância triplicado. Divida a absorvância média pelo valor obtido a partir de uma média de absorbância em poços contendo 0 µ g/mL nanopartículas.Nota: Estes poços que não contêm nenhuma AuNPs servem como controles para calcular porcentagem viabilidade celular em resposta ao tratamento de nanopartículas administrado em outros poços. Avaliação de microscopia confocal de fluorescência de captação de nanopartículas nas células endoteliais aderentes com glicocálix intacta ou disfuncional11 Semente 1.0 x 104 células/cm2 rato gordura células endoteliais para as lamelas de vidro de 12mm estéril da almofada e alimentar as células com DMEM suplementado com 10% fetal bovino soro e 1% penicilina/estreptomicina. Permitir que as células a crescer a confluência completa na umidade e incubadoras de CO2 controlada a 37 ° C, por aproximadamente 3 dias. Adicione tratamentos para modificar o glicocálix, se aplicável. Por exemplo, 2 h tratamento de culturas de células endoteliais com 2,5 x 10-6 IU heparinase enzima III degrada o glicocálix por clivagem especificamente seu componente de sulfato de heparan.Nota: Glicocálix saudável pode ser modelado através do crescimento das células endoteliais, conforme descrito na etapa 5.5.1 sem a adição de enzimas de degradação. Com o glicocálix endotelial intacta ou processado disfuncional, Incube as células endoteliais com AuNPs fluorescente em 550 µ g/mL para 16 h ou outra hora desejada. Lave delicadamente as células com 2 mL de 37 ° C 1% albumina de soro bovino em solução salina de tampão fosfato (PBS; contendo 100 mg/L cálcio e magnésio 100 mg/L). Mergulhe as células em 2 mL de paraformaldeído 2% e 0,1% de glutaraldeído em PBS e permitir que as células corrigir por 30 min à temperatura ambiente. Remover a solução de fixação de aldeído e lavar as células com temperatura PBS em 3 ciclos de 5 min. Antes da aplicação do anticorpo primário, expor as células endoteliais de soro de cabra de 2% em PBS durante 30 min à temperatura ambiente para bloquear sites de ligação não-específica. As células devem ser totalmente cobertas pela solução do bloqueio. Incube as células endoteliais durante a noite com o anticorpo primário de 1% anti-heparan sulfato em 2% de soro de cabra em PBS em 4 ° C para rotular o componente de sulfato de heparan do glicocálix. Certifique-se de que as células fixas são totalmente em contato com a solução de anticorpo. No dia seguinte, lave o anticorpo com temperatura PBS em 3 ciclos de 10 min. Incube as células endoteliais com 1:1,000 diluição do anticorpo secundário fluorescente apropriado por 30 min à temperatura ambiente, no escuro ou coberto com papel alumínio. Lave o anticorpo secundário com temperatura PBS em 3 ciclos de 10 min. Monte a lamela em corrediças do microscópio usando um meio de montagem de anti-desvaneça-se contendo 4′ 6-diamidino-2-phenylindole, dicloridrato (DAPI) para coloração de núcleos. Sele as bordas da lamela usando esmalte. Imagem da célula endotelial fluorescente immunostained amostras com microscopia confocal, usando canais muito vermelhos, verdes e azuis para visualizar os núcleos, glicocálix sulfato de heparan e as nanopartículas, respectivamente.