Endotel hedefleme için Functionalized 10-nm polimer kaplı altın parçacıkları ve ilaç dağıtım sentezi

1. hazırlık veya edinim hisse senedi Çözümleri (oda sıcaklığında saklanması için veya kullanım kadar dondurulmuş) 1 M sodyum hidroksit (NaOH) hisse senedi çözüm 400 mg 10 mL ultrasaf su oda sıcaklığında NaOH eriterek ve iyi malzeme karıştırma hazırlayın.Not: Ultrasaf su tanecikleri, bakteri, enzimler, iyonlar veya organik izleri gibi yabancı maddelerin susuz olarak tanımlanır. Arıtma sistemi kadar 18,2 mΩ·cm, düşük bir iyonik kirlenme gösteren onun direnci içinde kaynaklanan ultrasaf su elde etmek için kullanılır. Piyasada bulunan şişe ultrasaf su kullanımı önerilmez. Şu andan itibaren bu ultrasaf su su, aksi belirtilmedikçe sevk edilecek. 6 M NaOH hisse senedi çözüm 10 mL su 2.4 g NaOH çözülerek hazırlamak ve çözüm oda sıcaklığında saklayın. Chloroauric asitin esterleri (HAuCl4) 250 mM hisse senedi çözüm kurutulmuş HAuCl4 ‘ te 10,16 mL su 1 g çözülerek hazırlayın. 250 mm HAuCl4 25 mM HAuCl4çalışma konsantrasyonu elde etmek için 9 mL su ile 1 mL seyreltik. HAuCl4 çözüm oda sıcaklığında saklayın. 0.1 M karbonat tampon pH 8.8, 84 mg sodyum bikarbonat 10 mL suda eriyen ve 1.2 adımından 6 M NaOH ekleyerek 8.8 için pH ayarlama hazırlayın. Karbonat arabellek oda sıcaklığında saklayın. 20 mL tetrazolium bileşik, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium tuz (MTS), teskin Aracısı ile phenazine ethosulfate (PES) mix ( Tablo malzemelerigörmek). Aliquots (için en fazla 10 donma-çözülme döngüsü) MTS/PES karışımı karanlıkta-20 ° C’de depolayın. 2. altın nanopartikül çekirdek sentezi 12 µL % 80 ekleyerek seyreltilmiş bir THPC çözüm hazırlamak su oda sıcaklığında microcentrifuge tüp içinde 1 ml suda THPC. 100 mL yuvarlak alt şişesi bir manyetik heyecan tabak Merkezi güvenli. 45 mL su şişesi dökün ve su 300 yumurta şekilli küçük manyetik heyecan çubuğunu kullanarak devir / dakikada ilave edin. 0.5 mL 1 M NaOH ve 1 mL sulandırılmış THPC çözeltisi ekleyin. 5 min için şiddetle tepki karışımı heyecan devam ediyor. Devam karışımı karıştırma ve 2 mL 25 mM HAuCl4 çözüm ekleyin. Karışım rengi sarıdan koyu kahverengi THPC oluşumu ile negatif bir yük AuNPs şapkalı belirten saniye içinde değişecektir. Tam altın çekirdek oluşumu için izin vermek ek bir 15 dakika karışımı ilave edin. 3. altın nano tanecikleri çevresinde polimer Corona eklenmesi 2.3. adımda açıklanan 15 dk, PEG çözümler her aşağıdaki 4 mL cam şişe 1 mL suda çözülerek hazırlık yapabilmek: 30 mg NH2-PEG-SH; 7.5 mg m-PEG-SH; 7.5 mg COOH-PEG-SH.Not: Elde edilen konsantrasyonlarda 8.8 M NH2olmalıdır-PEG-SH, 3,75 M m-PEG-SH ve 3,75 M COOH-PEG-SH. PEG eklemek 100 rpm, yuvarlak alt şişeye çözümde karıştırma hızını azaltarak sonra çözüm THPC çözüm dropwise AuNPs şapkalı. Karışımı yavaşça gecede, oda sıcaklığında THPC verimli kaldırılması ve yerine Peg emin olmak için heyecan devam ediyor. Önümüzdeki 72 saat için bir 12-14 kDa molekül ağırlığı kesme selüloz membran karşı bir 4 L kova 60 rpm’de karıştırılmış su karıştırılmış karışımı diyaliz için kullanın. Diyaliz klipleri tarafından membranlar uçları kravat ve çözüm pipet ile aktarın.Not: Bu diyaliz işlemi 12-14 kDa kesme membran ile sadece unreacted PEG, THPC ve diğer kimyasal Reaktanları tarafından Difüzyon konsantrasyon degrade boyunca kaldırır. Yüksek konsantrasyon gradyanı korumak ve sürekli Difüzyon teşvik için su her 2 için ilk 6 h s ve her 6-12 h kalan 66 h için değiştirin.Not: Erken doğum, örnek içinde başlangıçta yüksek konsantrasyon nedeniyle oluşan hızlı Difüzyon karşılamak için bu su zamanlamasını değiştirme amacı budur. Nano tanecikleri, precipitates, toplamları ve diğer büyük boy kirleri 12-14 kDa kesme membran gözenekleri geçirilemez çünkü diyaliz işlemi nanopartikül çözüm yarı arıtılmış, yaprakları açıklanmıştır. Yarı arıtılmış nanopartikül çözüm bir 50 mL konik tüp kalan precipitates, toplamları ve diğer büyük boy kirleri çıkarmak için 0.2 µm şırınga filtre kullanarak filtre. Konik tüp-80 ° C dondurucuya yerleştirin ve yaklaşık 5 h için dondurmak saflaştırılmış pegile AuNP (PEG-AuNP) çözüm sağlar. Arıtılmış PEG-AuNP lyophilize için bir donma kurutma makinesi kullanın. Kuru, saflaştırılmış PEG-AuNP 4 ° C’de kullanmak kadar saklamak. 4. conjugating N-hydroxysuccinimide (NHS) Ester NH2 gruplar üzerine PEG-AuNP üzerinde kullanarak Fluorophores 50 mL yuvarlak alt şişesi bir manyetik heyecan tabak Merkezi güvenli. Şişeye 18 mL su ile doldurun ve su 100 bir manyetik karıştırın yumurta şeklinde çubuğunu kullanarak devir / dakikada ilave edin. Lyophilized PEG-AuNP 2 mg yüksek hassasiyetli benchtop Skala ile 4 mL konik tüpte, tartın. Bir anti-statik silah statik yük ve boru yüzey için PEG-AuNP toz yapışan ortadan kaldırmak için kullanın. 2 mL su tüp ekleyin. 2 mL PEG-AuNP çözüm daha fazla toplam rekonstitüsyon 20 ml su için yuvarlak alt şişe içine dökün. 100 bir manyetik karıştırın yumurta şeklinde çubuğunu kullanarak devir / dakikada karışımı heyecan devam ediyor. 1 mL 0.1 M ekleyin, pH 8.8 karbonat arabelleğe Sulandırılan AuNP yuvarlak alt şişeye bulunan 20 mL. Karıştırmaya devam. 10 mg/mL floresan NHS ester 5 µL Dimetil sülfoksit ekleyin.Not: Bu süreçte herhangi bir floresan boya kullanılabilir. Floresan PEG gecede karıştırın. Oda sıcaklığında tutmak ve folyo kaplı. Önümüzdeki 72 saat için aşırı fluorophores 3.3. adımda anlatılan protokolünü kullanarak kaldırın. Kısaca, bir 4 L kova su ve bir 12-14 kDa molekül ağırlığı kesme selüloz membran kullanarak karıştırılmış karışımı diyaliz. Değişmek belgili tanımlık su her 2 h ilk 6 s ve her 6-12 h kalan 66 h için. 1 mL aşağıda 5 bölümünde açıklanan karakterizasyonu için kullanılacak arıtılmış floresan PEG-AuNP çözeltisi, elde edilir. Donma ve 3.5-3.7 adımlarda açıklandığı gibi 4 ° c, depolama için toz formunda floresan nano tanecikleri elde etmek için kalan çözüm lyophilize. 0.2 µm şırınga filtre sterilize etmek ve bir kez yeniden hücre kültür uygulamaları için herhangi bir potansiyel precipitates kaldırmak için kullanın. 5. floresan pegile altın nano tanecikleri karakterizasyonu Altın nanopartikül çekirdek görselleştirmek ve boyutları ölçmek için iletim elektron mikroskobu (TEM) kullanma 10 µL arıtılmış floresan PEG-AuNP çözüm bir karbon kaplama mesh TEM ızgara üzerine bırakın. 5 dk sonra dikkatle PEG-AuNPs geride floresan içeren bir film kadar TEM kılavuz kenarından uzak aşırı sıvı fitil için filtre kağıt kullanın. Floresan PEG-AuNPs 80 görüntülemek kV ve büyütmede 50.000-150, 000. Dijital fotoğraf çekmek.Not: PEG elektron TEM üzerinde yoğun olmadığı için sadece altın çekirdek görünür. Bir ölçüm yazılımı kullanarak, ölçek çubuğu için ilişki içinde ölçü ölçeği ayarlamak. Çapları yaklaşık 20 altın çekirdek hesaplamak ve ortalama altın göbek çapı belirleyin.Not: TEM görüntüleme sistemi otomatik olarak dijital fotoğraf üzerinde bir ölçek çubuğu yerleştirir. Hidrodinamik nanopartikül boyutu dinamik ışık saçılma (DL) kullanarak ölçülmesi 4.2. adımda açıklanan yaklaşım kullanarak bir microcentrifuge tüp içine 1 mg liyofilize THPC kaplı AuNPs transfer. 1 mg liyofilize PEG-AuNP ayrı bir tüp aktarın. Her tüp için 1 mL su ekleyin ve her AuNP çözüm şeffaf plastik bir 1 mL transfer. Bir küvet bir DLS aleti yerleştirin ve küresel hidrodinamik çapları DLS sisteminde bulunan parçacık analyzer yazılımı kullanarak ölçün. Bir çubuk grafik biçimi kullanarak ölçülen hidrodinamik çapları arsa.Not: Histogram nano tanecikleri boyutuna göre gruplandırır. Nano tanecikleri en büyük grup bu protokol için sentezlenmiş AuNPs boyutunu en iyi tanımlayan çapı açıklığa kavuşacaktır. Fluorometrik Floresans onayNot: Aynı örnek ve küvet adım 5.2 floresan sinyal ölçmek için kullanılabilir. Küvet DLS çıkarıp bir spectrofluorometer yerleştirin. 650-800 nm dalga boyu aralığı uyarma dalga boyu 633 nm ve okunur verilmiş floresan sinyallerini küme. Zirve yaklaşık 665 olduğunu doğrulayın emisyon zirveye NHS için ilişkili olan nm.Not: uyarma ve emisyon dalga boylarında sürecinde kullanılan fluorophore göre ayarlayın. MTS Biyouyumluluk değerlendirmek için11 tahlil Bir 96-şey açık alt steril doku kültürü tedavi plaka, Dulbecco’nın modifiye kartal orta 100 µL pipet (DMEM; % 10 fetal sığır serum ve % 1 penisilin/streptomisin ile desteklenmiş) ve 3.2 x 103 hücreleri her kuyuya.Not: Bu çalışmada, sıçan yağ yastığı endotel hücreleri kullanılır. Toplam 21 Wells için 3 çoğaltır her biri (bkz. Adım 5.4.3 ilgi belirli konsantrasyonları için) 7 farklı nanopartikül konsantrasyonu için izin vermek için kullanılır. Hücreleri confluency nem ve % 5 CO2 kontrollü İnkübatörler 37 ° C11içinde büyümeye izin. Bireysel microcentrifuge tüpler, her DMEM 300 µL çeşitli konsantrasyonları nano tanecikleri ile içeren hazır olun. Bu çalışmada DMEM 7 farklı tüpleri aşağıdaki PEG-AuNP konsantrasyonları ile gerektirir: 0 µg/mL, 10 µg/mL, 50 µg/mL, 100 µg/mL, 250 µg/mL, 500 µg/mL ve 1000 µg/mL. Tüp DMEM Aspire edin. Nüsha wells 0, 10, 50, 100, 250, 500 ve 1000 µg/mL AuNP içeren DMEM medya 100 µL ile doldurun. Hücreleri ve önceden belirlenmiş bir süre boyunca, burada 16 h için ortak kuluçkaya nano tanecikleri sağlar. Kuluçka dönemi sona yakın, adım 1.5 MTS/PES karışım çözülme. Kuluçka sonra DMEM ve kuyulardan askıya alınmış, gevşek ekli nano tanecikleri Aspire edin. Taze DMEM ile birlikte 20 µL MTS/PES çözüm 1:5 MTS/PES üreticinin protokolüne göre DMEM oranı elde etmek için 100 µL ekleyin. MTS/PES hücrelerle 37 ° c 2 h için kuluçkaya.Not: Bu 2 h kuluçka zaman endotel hücreleri metabolik aktivite tarafından belirlenir ve en fazla 4 saat için diğer hücre tipleri için arttı. 2 h dönem içindeki MTS DMEM ile karışımları renkli formazan içine endotel hücreleri tarafından metabolize. PEG-AuNP Biyouyumluluk ve hücre canlılığı olasılığı daha renkli formazan ile gösterilecektir. PEG-AuNP ve hücrelerin ölüyor şans toksisitesi daha az yoğun rengiyle gösterilecek. 492 Absorbans okuyarak her şey Renkölçer analizini gerçekleştirmek nm ile uyumlu plaka okuyucu. Her nanopartikül konsantrasyonu için onaylatılacak Absorbans değerleri üzerinden ortalama Absorbans hesaplayın. Ortalama Absorbans Absorbans 0 µg/mL nano tanecikleri içeren Wells ortalama üzerinden alınan değeri bölün.Not: denetimleri yüzde hücre canlılığı diğer wells yönetilen nanopartikül tedaviye yanıt olarak hesaplamak için hiçbir AuNPs içeren bu kuyuları görevi. Floresan confocal mikroskobu nanopartikül anlamazdın yapisan endotel hücreleri sağlam ya da işlevsel olmayan glycocalyx11 ile değerlendirilmesi Tohum 1.0 x 104 hücreleri/cm2 sıçan yağ steril 12 mm cam coverslips üzerine endotel hücreleri yastık ve hücrelerin % 10 fetal sığır serum ve % 1 penisilin/streptomisin ile desteklenmiş DMEM ile beslemek. Hücreleri yaklaşık 3 gün boyunca tam confluency nem ve CO2 kontrollü İnkübatörler 37 ° C’de büyümeye izin. Glycocalyx değiştirmek için Tedaviler varsa ekleyin. Örneğin, 2. 5 x 10-6 IU heparinase III enzim ile kültürlü endotel hücrelerinin 2 s tedavi özellikle kendi heparan sülfat bileşeni fizyon tarafından glycocalyx alçaltır.Not: Sağlıklı glycocalyx endotel hücre yıkımı enzimler ek olmadan 5.5.1 adımda açıklandığı gibi büyüyerek modellenebilir. Sol bozulmamış veya işlevsiz hale endotel glycocalyx ile endotel hücreleri floresan AuNPs 16 h için 550 µg/mL veya istenen diğer zamanı ile kuluçkaya. 37 ° C % 1 sığır serum albümin fosfat tamponlu tuz (PBS; 100 mg/L kalsiyum ve 100 mg/L magnezyum içeren) içinde 2 mL içeren hücreleri nazikçe yıkayın. % 2 paraformaldehyde 2 mL hücrelerde ve PBS %0,1 oxazolidin daldırın ve hücreleri saptamak için oda sıcaklığında 30 dakika bekleyin. Aldehid sabitleme çözümü kaldırmak ve oda sıcaklığında PBS hücrelerle üç dakika 5 devredir yıkayın. Birincil antikor uygulama öncesinde, PBS içinde % 2 keçi serum spesifik olmayan bağlayıcı siteleri engellemek için oda sıcaklığında 30 dakika için endotel hücreleri göstermek. Hücreleri tamamen engelleme çözüm ile kaplı olmalıdır. Gecede %1 anti-heparan sülfat birincil antikor Serumda % 2 keçi PBS içinde glycocalyx heparan sülfat bileşeni etiketlemek için 4 ° c ile endotel hücreleri kuluçkaya. Sabit hücreleri antikor çözüm ile temas halinde tam olduğundan emin olun. Ertesi gün, oda sıcaklığında PBS ile antikor dışarı üç 10 dk devredir yıkayın. Karanlık veya alüminyum folyo kaplı oda sıcaklığında 30 dk için uygun floresan ikincil antikor 1:1,000 seyreltme ile endotel hücreleri kuluçkaya. Oda sıcaklığında PBS ile ikincil antikor dışarı üç 10 dk devredir yıkayın. Coverslip 4’, 6-diamidino-2-phenylindole, içeren bir anti-fade montaj orta dihydrochloride (DAPI) Boyama çekirdekler için kullanma mikroskop slayta bağlayın. Tırnak cilası kullanarak coverslip kenarlarını kapatın. Görüntü floresan immunostained endotel hücre çekirdekleri, heparan sülfat glycocalyx ve nano tanecikleri, sırasıyla görselleştirmek için mavi, yeşil ve çok kırmızı kanalı kullanılarak confocal mikroskobu ile örnekler.