Мы описываем метод синтеза биологически наночастиц золота 10 Нм, функционализированных покрытие поли-этиленгликоля на поверхность. Эти частицы могут быть использоваться в пробирке и в естественных условиях для оказания терапии наноразмерных клеточной и внеклеточной пространств, трудно доступ с размерами обычных наночастиц.
В медицинских исследованиях из-за их размера, биосовместимость и изменяемые поверхности широко использовались наночастиц золота (AuNPs). Ориентации и наркотиков доставки являются некоторые из применений этих AuNPs, но эндотелиальной внеклеточной матрицы оборонительных свойства препятствуют частиц поглощения. Для решения этой проблемы, мы описываем метод синтеза для сверхмалых наночастиц золота для повышения сосудистого доставки, с настраиваемыми функциональными группами и полимерные длины для дальнейшей корректировки. Протокол урожайность 2,5 Нм AuNPs, покрытые тетракис (гидроксиметил) фосфониевых хлорид (THPC). Замена THPC с гетеро функциональные полиэтиленгликоля (PEG) на поверхности AuNP увеличивает гидродинамические радиус до 10,5 Нм при оказании различных функциональных групп на поверхности. Последняя часть протокола включает в себя факультативное добавление Флюорофор разрешить AuNPs быть визуализированы под флуоресценции для отслеживания наночастиц поглощения. Диализ и лиофилизации были использованы для очистки и изоляции AuNPs. Эти люминесцентные наночастицы могут быть визуализированы в экспериментах в пробирке и в естественных условиях благодаря биосовместимых PEG покрытия и флуоресцентных зондов. Кроме того диапазон размеров эти наночастицы делают их идеальным кандидатом для зондирования Гликокаликс без нарушения нормальной сосудистую функцию, которая может привести к улучшению доставки и терапии.
Наночастицы были применены для доставки лекарств и изображений для его способность перемещаться через тело, чтобы достичь целевых областей интерес1,2. Частицы могут накапливаться внутри опухоли через сосудистую Дырявый или локализовать где целевой лигандом оверэкспрессировали и воздействию. Золото, в частности, стал часто используемые наночастиц материал из-за его уникальной химические и физические свойства, которые влияют на транспорт и выпуск терапии3. Золото является эффективным наночастиц материалом, потому что его поверхность может быть изменен для привязки к тиолами и обладает высокой биосовместимостью, из-за его низкой токсичности4. AuNPs могут быть перевозчиков наркотиков больших биомолекулярных и добились успеха в предоставлении пептиды, нуклеиновых кислот и белков, позволяя AuNPs быть благоприятной для ориентации2,4.
К сожалению эффективность доставки наркотиков наночастиц сдерживается отрицательно заряженных Гликокаликс, который является внеклеточным пальто на мембраны для большинства клеток млекопитающих и имеет размеры поры до 7 Нм5,6. Этот размер поры меньше, чем большинство перевозчиков наркотиков наночастиц, которые имеют типичный диапазон диаметров 50-200 Нм. В условиях болезнь эти поры Гликокаликс становится больше из-за деградации, увеличение проницаемости через эндотелиальных клеток. Однако большинство наночастиц все еще слишком велик, чтобы воспользоваться этой структурных изменений в Гликокаликс. Одним из следствий этой рассогласование размера является, что условно размера частиц не выгодно взаимодействовать с эндотелиальных клеток, которые выстилают кровеносных сосудов. Это влияет на поставки внутривенно управляемых частиц в эндотелия и можно сказать частиц транспорта через крови мозга барьер7,8,9,10.
Один из подходов к борьбе с этой проблемы — использовать мелкие частицы проходят через мелкие поры в Гликокаликс. Здесь мы синтезировать 10,5 Нм сверхмалых золотых наночастиц, который обычно должен сдерживаться нетронутыми, здоровые Гликокаликс. Как только Гликокаликс начинает ставиться, наночастиц должны легко проникают в клетки путем увеличения размера пор. Протокол в этом документе подробно синтез сверхмалых золото ядра, покрытые PEG, который увеличивает биосовместимость и уменьшает системный клиренс4. ПРИВЯЗКИ также может содержать несколько типов функциональных групп, открывая возможности для сопряжения таргетинга лигандов, флуорофоров и терапии. Ранее опубликованные результаты показывают, что эти сверхмалых наночастиц, как правило, быть рассмотрен более благоприятно в регионах нарушается Гликокаликс эндотелиальной функции даже без каких-либо активной ориентации4,11. Это указывает на целесообразность и важность использования частицы правильного размера для доставки приложений. Следующий протокол представляет синтеза, очистки и характеристика PEG-покрытием AuNPs (PEG-AuNP), с обсуждения для пошива функциональных групп и спряжения для других приложений.
Этот метод является эффективным методом для синтеза настраиваемый, сверхмалых КОЛЫШЕК с покрытием AuNPs. Важной частью этой процедуры является первоначальный формирования THPC максимум золота, наночастицы, который может быть подтвержден изменение цвета от желтого до коричневого, что будет происходить после того, как HAuCl4 был добавлен к содержимому в колбу круглым дном (шаг 2.3 протокол). Без изменения цвета показывает, что существует не наночастиц сформирован и что первоначальные шаги следует проверить и повторил прежде. В случае, если цвет изменится на нечто иное, чем коричневый Винно-красный или серый результате частицы, вероятно, не будет вокруг целевой 2,5 Нм и новой партии следует также.
После формирования ядро золото обмен THPC КОЛЫШЕК и очистительные процедуры содержат несколько ключевых шагов для успешного завершения протокола. Смешивание на ночь позволяет для замены реакции идти до конца. Неудачных очистки может произойти, если вода диализа не изменяется с установленной частотой. Агрегации и осаждение частиц также может возникать, если частицы остаются в диализа для более чем 72 ч. Другие потенциальные проблемы могут наблюдаться во время замораживания сушки. Если сверхмалых КОЛЫШЕК с покрытием AuNP решение не было полностью заморожено или лиофилизатор не был установлен корректно, образцы могут быть потеряны. Обратитесь к руководству лиофилизатор, некоторые виды оборудования могут потребоваться различные образцы препаратов.
Простота синтеза и биосовместимость результате частиц представляют преимущества использования этих PEG-AuNPs. Кроме того эти наночастицы имеют преимущество в состоянии взаимодействовать с наноразмерных клеточных структур, что подтверждается возможность выявления деградированных Гликокаликс путем поглощения этих наночастиц. Это преимущество может быть использованы для разработки новых методов лечения атеросклероза и превентивных мер. Помимо того, что мы представляем здесь, еще одно преимущество этого протокола, что она позволяет обширные настройки частиц, а также увеличение стабильности и возможностей хранения путем присоединения тиоловых, содержащие ПЭГ на наночастиц золота4. Другой конец цепи PEG может содержать любую функциональную группу, и множество молекул может быть конъюгированных для этих групп. В этом протоколе, прилагаются все три общих функциональных групп (метил, карбоксильные и аминокислот). Отношение КОЛЫШЕК, решили сначала приоритеты флуоресцентного обнаружения, то возможность включения вторичных таргетинга общие, с помощью группы карбоновые кислоты. Соотношения этих групп может быть tweaked на основании приложения, и также может быть скорректирована длины и формы полимеров.
Для измерения поглощения частиц, мы конъюгированных флуоресцентного зонда к одной из функциональных групп. Следует отметить, что любой спряжение за то, что мы описали приведет к изменению свойств поверхности наночастиц. Каждой итерации наночастиц в отношении дополнительных компонентов и спряжение реакции должны быть проверены на желаемые свойства.
Этот метод производит сверхмалых наночастиц золота, предназначенных для преодоления оборонительных свойства эндотелия внеклеточного Гликокаликс, что затрудняет усвоение условно размеров наночастиц. Однако малый размер одалживает к сложности в визуализации и наркотиков, Загрузка аспект. Эти частицы значительно меньше, чем типичный наночастиц размер диапазона, и в результате значительно уменьшается площадь поверхности для вложений терапии и ориентации постановление. Это может привести к сложности, собирание индивидуальных сигналов в визуализации приложений, хотя по-прежнему кластеры частиц могут быть легко определены, как показано в конфокальных изображения. Сокращение поверхности для вложений таргетинга лигандов и терапии может потребовать больше частиц под управлением для достижения цели дозировка требований. Однако мелкие частицы будет более эффективным в доставке, когда учетом Гликокаликс.
Эти Роман сверхмалых частиц способны доставки в трудно достичь наноразмерных областей внутри тела с минимальным ущербом микроокружения. Добавление привязки позволяет для увеличения биосовместимость и предлагает функциональные группы для настройки тяжелых частиц для различных приложений. Меньшего размера по сравнению с типичными наночастиц поставляется с некоторые недостатки, но если разработаны стратегически, сверхмалых частиц является перспективным подходом к размещение трудно проникнуть, сложных и хрупких Гликокаликс в сосудистой Доставка ориентации и наркотиков.
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана Северовосточный университет Химическая инженерия, начальных средств и Tier 1 экспериментального исследования грант от северо-восточного университета Благочинный бюро, низ K01 HL125499 и NSF-IGERT Грант NSF/DGE-096843. Авторы хотели бы также поблагодарить Thomas J. Вебстер и его лаборатории за их помощь, а также Nanomedicine науки и технологического центра и фармацевтических наук Департамента в северо-восточном университете.
Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma Aldrich | 795429 | |
Gold (III) Chloride trihydrate (HAuCl4.3H2O) | Sigma Aldrich | 520918 | |
Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | |
Tetrakis (hydroxymethyl) phosphnium chloride | Sigma Aldrich | 404861 | |
Mono-functional mPEG-thiol | Layson Bio Inc. | MPEG-SH-2000-1g | Mw: 2,000 Da |
hetero bi-functional anime-PEG-thiol | Layson Bio Inc. | NH2-PEG-SH-3400-1g | Mw: 3,400 Da |
Carboxymethyl-PEG-thiol | Layson Bio Inc. | CM-PEG-SH-2000-1g | Mw: 2,000 Da |
Cellulose dialysis membrane (12-14 kDa) | Sigma Aldrich | D9777 | |
Zerostat anti-static instrument | Sigma Aldrich | Z108812 | |
Alexa Fluor 647 (AF647) carboxylic acid succinimidyl ester | Fisher | A20006 | Fluorophore |
Fisherbrand Qualitative Grade Plain Filter Paper Circles – P5 grade | Thermo Fisher Scientific | 09-801-B | |
Transmission electron microscopy | JEOL USA | JEOL JEM-1000 | TEM |
Dynamic Light Scattering | Brookhaven Instruments Corporation | Brookhaven 90 Plus Particle Size Analyzer | DLS |
Fluorometer | Horiba Scientific | Jobin Yvon Fluromax 4 | Fluorometer |
CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) | Promega | G3582 | MTS |
Plate reader | Molecular Devices | SpectraMax M4 | Plate reader |
10E4 epitope HS mouse monoclonal IgM antibody (primary antibody) | Amsbio | 370255 | Primary antibody |
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (secondary antibody) | Thermo Fisher Scientific | R37120 | Secondary antibody |
VECTASHIELD mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1000 | With DAPI |
Confocal Microscope | Carl Zeiss Meditex AG | Zeiss LSM 700 | Confocol microscopy |