גזע המוח השמיעתית תגובה והקלטה החיצוני תא שיער תיקון שלם-תא קלאמפ בחולדות כמחנכת
Summary
פרוטוקול זה מתאר שיטות כדי להקליט התגובה גזע המוח של עכברוש לאחר הלידה הגורים. לבחון התפתחות תפקודית של תאים שיער החיצוני, ההליך ניסיוני של קלאמפ תיקון שלם-תא הקלטה בתאים מבודדים שיער החיצוני מתואר צעד אחר צעד.
Abstract
תא שיער החיצוני הוא אחד משני הסוגים של תאי חישה שיער ב שבלול יונקים. הם לשנות אורכם תא עם הקולטן פוטנציאליים כדי להגביר את הרטט חלש של אותות קול ברמה נמוכה. מורפולוגיה ורכוש אלקטרופיזיולוגיות של תאים שיער החיצוני (OHCs) להתפתח מוקדם הגילאים כמחנכת. ההבשלה של תא שיער החיצוני יכול לתרום להתפתחות של מערכת השמיעה. עם זאת, התהליך של פיתוח OHCs לא למדה היטב. זה גם בגלל הקושי למדוד את תפקידם על ידי גישה אלקטרופיזיולוגיות. במטרה לפתח שיטה פשוטה כדי לטפל בבעיה לעיל, כאן אנו מתארים פרוטוקול צעד אחר צעד כדי ללמוד את הפונקציה של OHCs ב שבלול בחריפות הפומבית של חולדות כמחנכת. בשיטה זו, אנו יכולים להעריך את התגובה שבלולי לגירויים צליל טהור, לבחון את רמת הביטוי והתפקוד של prestin חלבון מנוע ב- OHCs. שיטה זו יכולה לשמש גם כדי לחקור את תאי השיער הפנימי (IHCs).
Introduction
שתי פונקציות שונות של שבלולי תאים שיער החישה הם חיוניים עבור יונקים שמיעה: mechanoelectric התמרה חושית (MET) ו- electromotility1,2. על ידי ערוצי MET ממוקם על הצרור שיער, IHCs (IHCs) OHCs המר רטט קול לתוך שינויי פוטנציאל ממברנה, כמו גם את האותות החשמליים של ספירלה innervated גנגליון נוירונים. OHCs לשנות את אורכם תא עם קרום פוטנציאליים ומגבירים את הרטט של קול ברמה נמוכה. פעילות זו כינה electromotility נגזר על ידי prestin חלבון המנוע ממוקם בקיר הלטראלי של OHCs3.
במינים רבים כולל מכרסמים, הפונקציה שמיעה היא בשלה4,מוקדמת אפוק כמחנכת5. אין פוטנציאל פעולה בתגובה אותות קול יכול להתגלות בקליפת המוח השמיעתית לפני6,תחילת7שמיעה. התפתחות המורפולוגיה והתפקוד של שבלול נחקרה נרחב העכבר, גרביל, עכברוש-4,–5,–8. Mechanotransduction ואת electromotility של תאים שיער מפותחים גם בתחילת החיים אפוק5.
על מנת להעריך את הרגישות שמיעה של חולדות בגילאים שונים כמחנכת, פיתחנו שיטה של גזע המוח השמיעתית תגובה (ABR) הקלטה עכברוש הגורים. תיקון שלם-תא קלאמפ היא טכנולוגיה אידיאלי כדי לחקור את OHCs electrophysiologically. עם זאת, בהשוואה את המלחציים תיקון הופיעה נוירונים ותאי אפיתל אחרים, שיעור נמוך של תאים שלמים איטום מוגבלת החקירה של electromotility של OHCs מבודדים.
כאן נתאר הליך כדי לחקור את OHCs מורפולוגית, electrophysiologically ב שבלול בחריפות הפומבית של חולדות כמחנכת. בשיטה זו יכול להיות שונה כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים המסדירים הפנימי תא שיער התפתחות ותפקוד.
Protocol
Representative Results
Discussion
בחולדות צעיר יותר היום ה-11, אין פוטנציאל פעולה בתגובה לגירוי צליל יכול להיות שנצפו בקליפת השמיעה6,7. לכן, כמחנכת היום ה-11 מתואר “תחילת הדיון”10. פיתוח שמיעה פונקציה לפני תחילת הדיון היה לא טוב למד עדיין. באמצעות השיטה דומה עבור הקלטת ABR למבוגרים, נדג…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים התוכנית 973 (2014CB943002), את נבחרת מדעי הטבע קרן של סין (11534013, 31500841).
Materials
| Anesthetic | |||
| Pentobarbital sodium | Sigma | P3761 | 1.5% in water |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection solution | |||
| Leiboviz's L-15 Medium | Life Technologies | 41300-039 | 1 pack in 1 L water |
| Collagenase IV | Sigma | C5138 | 2 mg/mL in L-15 |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | 10 mM |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunostaining solutions | |||
| PBS | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | PH 7.3 |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | 4% in PBS |
| Triton X-100 | Amresco | ZS-0694 | 0.3% in PBS |
| Normal goat serum | Thermo Fisher Scientific | 10000C | 10% in PBS |
| prestin antibody | Santa Cruz | SC-22694 | dil 1:200 |
| Alexa Fluor 488-conjugated antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11055 | dil 1:600 |
| Phalloidin-Tetramethylrhodamine B isothiocyanate | Sigma | P1951 | dil 1:200 |
| DAPI | Solarbio | C0060 | dil 1:20 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Extracellular solution | |||
| Leiboviz's L-15 Medium | Life Technologies | 41300-039 | 1 pack in 1 L water |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | 10 mM |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Intracellular solution | |||
| CsCl | Sigma | 7647-17-8 | 140 mM |
| MgCl2 | Sigma | 7791-18-6 | 2 mM |
| EGTA | Sigma | 67-42-5 | 10 mM |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | 10 mM |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Osmometer | Gonotec | OSMOMAT 3000 basic | |
| Forcep | WPI | 14095 | Tweezers dumont |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | MODLE-P97 | |
| Micro Forge | Narishigen | MF-830 | |
| Mini Operating System | Sutter Instrument | MP-285 | |
| MultiClamp | Axon | 700B | |
| Low-Noise Data Acquisition System | Axon | 1440A | |
| ES1 speaker | Tucker-Davis Technologies | ||
| TDT system 3 | Tucker-Davis Technologies | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| SigGenRP software | Tucker-Davis Technologies | ||
| BioSigRP software | Tucker-Davis Technologies | ||
| jClamp | Scientific Solutions | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal | |||
| SD rat | Experimental Animal Center of Southern Medical University |
References
- He, D. Z., Zheng, J., Kalinec, F., Sacchi Kakehata, S. S. a. n. t. o. s. -., J, Tuning in to the amazing outer hair cell: membrane wizardry with a twist and shout. J Membr Biol. 209, 119-134 (2006).
- Dallos, P. Cochlear amplification, outer hair cells and prestin. Curr Opin Neurobiol. 18, 370-376 (2008).
- Zheng, J., et al. Prestin is the motor protein of cochlear outer hair cells. Nature. 405, 149-155 (2000).
- Abe, T., et al. Developmental expression of the outer hair cell motor prestin in the mouse. J Membr Biol. 215, 49-56 (2007).
- Waguespack, J., Salles, F. T., Kachar, B., Ricci, A. J. Stepwise morphological and functional maturation of mechanotransduction in rat outer hair cells. J Neurosci. 27, 13890-13902 (2007).
- Zhang, L. I., Bao, S., Merzenich, M. M. Persistent and specific influences of early acoustic environments on primary auditory cortex. Nat Neurosci. 4, 1123 (2001).
- De, V. -. S. E., Chang, E. F., Bao, S., Merzenich, M. M. Critical period window for spectral tuning defined in the primary auditory cortex (A1) in the rat. J Neurosci. 27, 180-189 (2007).
- He, D. Z., Evans, B. N., Dallos, P. First appearance and development of electromotility in neonatal gerbil outer hair cells. Hearing Res. 78, 77-90 (1994).
- Hang, J., et al. Synchronized Progression of Prestin Expression and Auditory Brainstem Response during Postnatal Development in Rats. Neural Plast. , 4545826 (2016).
- Ehret, G. Development of absolute auditory thresholds in the house mouse (Mus musculus). J Am Audiol Soc. 1, 179-184 (1976).
- Møller, A. R. . Hearing:anatomy, physiology, and disorders of the auditory system. , (2006).
- He, D. Z., Zheng, J., Edge, R., Dallos, P. Isolation of cochlear inner hair cells. Hearing Res. 145, 156-160 (2000).
- Tang, J., Pecka, J. L., Tan, X., Beisel, K. W., He, D. Z. Z. Engineered Pendrin Protein, an Anion Transporter and Molecular Motor. J Biological Chem. 286, 31014-31021 (2011).
- Fu, M., et al. The Effects of Urethane on Rat Outer Hair Cells. Neural Plast. 2016, 1-11 (2016).
