シリアル セクション電子線トモグラフィーによるショウジョウバエ間接飛翔筋のミトコンドリア微細構造 3D

1. 章ショウジョウバエのティッシュ振動刃ミクロトームを使用して 氷の上のショウジョウバエの麻酔し、4% 低融点アガロース リン酸バッファー内の 1 つの mL で各 1 つのフライを浸します。氷の上を固めるための agarose を許可します。通常、4-6 ハエが処理されます。 Agarose のゲルに埋め込まれたショウジョウバエを 100 μ m の厚みでスライスをセクションし、0.1 M のリン酸バッファーで 2.5% グルタルアルデヒドを含む固定液に浸して振動刃ミクロトームを使用します。注: は、組織のアーキテクチャは、他の方法と比べてよりそのまま残るので最寄り Vibratome 断面です。また、0.1 M のリン酸バッファーで 2.5% グルタルアルデヒドを含む固定液に IFM を解剖するには、ピンセットを解剖を使用できます。 2. 高圧凍結と凍結置換 (HPF/FS) 法による EM 試料の準備 続いて 2 滴 (~ 100 μ L) 20 %bsa を用いたリン酸バッファーのリン酸バッファーの 3 滴 (~ 150 μ L) の組織切片を洗います。HPF の満ちているバッファーと 20 %bsa のゴールドのキャリア セクションに配置し。 ユーザー マニュアルによると高圧冷凍庫にキャリアを含んでいるサンプルをロードします。 フリーズの後液体窒素下でホルダーからのキャリアを解放し、-140 ° C に冷却凍結置換デバイスに転送 テーブル 12% グルタルアルデヒド、四酸化オスミウム 2%、0.1% アセトン酢酸ウランを含むカクテルの FS でのように、凍結置換プロトコルを実行します。 慎重に針をキャリアから標本を取り外します、室温で樹脂に試料を埋め込みます。65 ° C 16 h で樹脂を重合します。注意: 他のタイプのサンプルを準備する FS のプロトコルを変更ください。HPF/FS は微細構造を保持し、細胞内容の喪失を最小限に抑えるために好まれる。 また、化学固定のプロトコルを適用します。一晩 2.5% グルタルアルデヒドで標本を修正、バッファーで洗浄し、1% オスミウム四酸化 2 における洗浄と修正し、昇順エタノールの濃度によって脱水し潜入し、16 65 ° C で重合する前にスパー樹脂標本を埋め込むh。 3. 電子線トモグラフィーの標本のシリアル セクションを準備します。 組織を含む必要なブロックの顔を公開する試料ブロックをトリミングします。 金の粒子を前処理 (10 nm の直径の) 30 分洗浄 1 %bsa と PBS バッファー内の金粒子の中断と。マーカを作成する炭素皮膜で被覆された銅スロット グリッド上の金の粒子をオーバーレイします。 トモグラフィー買収の視野で十分なマーカ (少なくとも 5-10 マーカー) を持っている電子顕微鏡下で確認します。 200-250 nm、ウルトラミクロトームを用いた膜厚の切片をカットします。 薄片の完璧なループを使用してスロット グリッドの連続切片を収集します。 10 分間レイノルドの鉛クエン酸とセクションを染色します。 セクションの上に基準の金粒子の第 2 層をオーバーレイします。 4. 二重傾斜電子線トモグラフィーを収集します。 デュアル軸断層法ホルダーにグリッドに読み込むし、200 で透過型電子顕微鏡に挿入 kV。 ユーセン トリック フォーカスで顕微鏡を合わせます。 自動データ収集ソフトウェアを設定します。調整し、マルチ スケールの画像設定で電子ビームを揃えます。操作詳細10 (図 2) は、ユーザー マニュアルを参照してください。 断層レントゲン写真撮影のコレクションの設定の下で炭素フィルムなしの空の領域でのカメラ暗いと明るい参照を取得します。 低倍率でグリッド アトラスを収集します。断層レントゲン写真撮影のコレクション対象として連続切片にミトコンドリアを選択します。 +60 ° と 2 ° 刻みに-60 ° からフルティルト シリーズを取得ターゲットごとに軸 A。注: のチルト角は、試料ホルダーの設計によって機械的に制限されます。ホルダーは、高角度のビームをブロックします。 2 番目のフルティルト シリーズを収集するために試料ホルダー 90 ° を回転します。新しいアトラスを取得します。対応する位置を選択し、ターゲットごとに軸 b フルティルト シリーズを取得します。注: SerialEM、Xplore3D などの他のソフトウェア パッケージの自動データ収集があります。 5. 再構築 3 D 断層セグメントのサブボリューム ソフトウェアを使用して、 IMOD ソフトウェア11を使用してデュアル軸の傾き画像の再構築します。 操作の詳細についてはユーザー マニュアルを参照してください。 金マーカの位置によって個々 の傾斜シリーズで揃えます。両方の軸のため戻って投影法によってまたは同時反復再構成手法 (SIRT) 法による断層を再構築と軸 B、それぞれ (図 3)。 結合の軸 A と軸 B 二重傾斜断層削減不足しているウェッジの成果物を生成します。 カバー全体ミトコンドリア ボリュームの復元を取得する連続切片の二重傾斜断層が一緒に参加します。IMOD プログラムによって連続切片の間のギャップをモデル化します。 結合された断層と箱ボリューム分割の必要なサイズにトリミングします。 3 D ソフトウェアを利用した結合されたシリアル断画像を分析します。 操作の詳細についてはユーザー マニュアルを参照してください。 機能のコントラストを改善し背景の密度を減らすガウス フィルター (または他の目的のメソッド) で断層をフィルター処理します。 手動でまたは自動的に、ミトコンドリアの微細構造をセグメント化します。 3 D で検査できるようにセグメンテーション モデルを表示します。 3 D で利用可能なツールを使用してムービーを生成します。