3D أولتراستروكتوري الميتوكوندريا عضلة الرحلات غير المباشرة المورفولوجية كشفت عن طريق التصوير المقطعي الإلكترون المسلسل-القسم
Summary
في هذا البروتوكول، ونظهر تطبيق إلكترون المسلسل-قسم التصوير المقطعي لتوضيح الهيكل المتقدرية في العضلات المورفولوجية الرحلات غير المباشرة.
Abstract
الميتوكوندريا هي القوى الخلوية التي تنتج ATP، والدهون، ونواتج الأيض، فضلا عن تنظيم الكالسيوم التوازن وخلية الموت. يتم ترتيب أولتراستروكتوري غشاء مزدوج كريستاي الغنية الفريدة لهذا عضية أناقة الاضطلاع بمهام متعددة بتقسيم الجزيئات الحيوية. أولتراستروكتوري المتقدرية يرتبط ارتباطاً وثيقا بمهام مختلفة؛ بيد أن التفاصيل الدقيقة لهذه الدالة بنية العلاقات فقط بداية وصف. هنا، علينا أن نظهر تطبيق إلكترون المسلسل-قسم التصوير المقطعي لتوضيح الهيكل المتقدرية في العضلات المورفولوجية الرحلات غير المباشرة. إلكترون المسلسل-قسم التصوير المقطعي يمكن تكييفها لدراسة أي البنية الخلوية في ثلاثة أبعاد.
Introduction
المجهر الإلكتروني هو أداة قيمة لدراسة سياق الهيكلية لجمعيات سوبسيلولار والعضيات التي تقوم بالعمليات الخلوية. تم وضع أساليب للحفاظ على أولتراستروكتوري من الأنسجة أو الخلايا أما بالتثبيت الكيميائي مع الألدهيدات أو بالضغط العالي تجميد (HPF) متبوعاً بتجميد استبدال (خ)1،2. القطع جزءا لا يتجزأ من العينة قد ثم تكون مقطوع الملون ولاحظ مع انتقال إلكترون مجهر (TEM). العينة هبف يمكن أيضا معالجة ظروف البرد، كما هو الحال بتقطيع البرد أو بتركيز أيون شعاع (التعزيز) الطحن، ويراعي بالبرد-م3،4.
على الرغم من أن قسم رقيقة م يقدم أفكاراً المورفولوجية الزاخر بالمعلومات، 2D الصور الناتجة يمكن أن تكشف فقط أولتراستروكتوري لشريحة معينة. كيف يتم تنظيم أولتراستروكتوري في حجم ثلاثي الأبعاد ما زالت تحجب. من أجل تصور أولتراستروكتوري الخلوية في ثلاثة أبعاد، تم تطوير أسلوب التصوير المقطعي إلكترون حيث حصلت سلسلة من الصور إمالة والعودة المتوقعة لتوليد تعمير تمجربهك5 (الشكل 1). ويمكن جمع سلسلة مزدوجة ميل بالتناوب العينة 90°، والحصول على سلسلة ميل ثاني. وهذا سيقلل من التحف آسفين المفقودين التي تنجم عن أخذ عينات محدودة الزوايا وتحسين القرار من توموجرام.
وهنا يصف لنا تطبيق التصوير المقطعي الإلكترون المسلسل-قسم لدراسة أولتراستروكتوري المتقدرية المورفولوجية الرحلات غير المباشرة العضلات (IFM)6،7،،من89 . من أجل الحصول على إعادة البناء ثلاثي الأبعاد تغطي كامل الميتوكوندريا (حوالي 2.5 ميكرون سميكة)، تم الحصول على مقاطع المسلسل من كتل الأنسجة IFM المورفولوجية . جمعت توموجرامس من كل قسم على حدة باستخدام برامج جمع البيانات تلقائياً. تم إنشاؤها تمجربهك عمليات إعادة البناء وانضم توموجرامس المسلسل مع مجموعة إيمود للحصول على وحدة تخزين أعيد بناؤها في ميتوكندريا أكملها. وجرى تحليل توموجرامس انضم ببرامج 3D. كانت مجزأة كثافة mitochondrial cristae لإنشاء نموذج الانقسام التي كشفت المنظمة في ثلاثة أبعاد.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذا البروتوكول، يصف لنا لسير عمل أمثل لتطبيق التصوير المقطعي الإلكترون المسلسل-قسم لدراسة 3D أولتراستروكتوري المتقدرية المورفولوجية الرحلات غير المباشرة العضلات. المحافظة على أولتراستروكتوري في العينة هو التحدي التقني الرئيسي لهذا النوع من التحليل. وأدرجت الخطوات حفاظا على أفضل أولتراستروكتوري اثنين المنهجية. أولاً، كانت عينات الأنسجة بتقطيع مع تهتز مبضع بليد بغية الحفاظ على بنية الأنسجة بقدر الإمكان. وثانيا، كان الأمثل بروتوكول هبف/خ للحفاظ على أولتراستروكتوري عضية أثناء إعداد كتل العينة جزءا لا يتجزأ. وتم تجميد العينات تحت ضغط عال، مما يقلل من نقطة التجمد للمياه ويقلل من تكوين بلورات الجليد التي تلف أولتراستروكتوري1. يمكن الشركة إنتاج على الفور العينات سميكة مثل 0.1 ملم، وثم يتعرض لتجميد استبدال لتوليد كتل العينة لتحليل م. تحسين الحفاظ على أولتراستروكتوري من هبف/خ لوحظ عند مقارنتها بأساليب التثبيت الكيميائي. استخدام هذه السلسلة من الخطوات لإعداد عينة، تحسن كبير الحفاظ على أغشية مزدوجة mitochondrial والأغشية كريستي.
الحصول على مقاطع المسلسل للعينة هو الخطوة الأكثر تحديا للأسلوب. كشعاع الإلكترون قد تغلغل قوة محدودة، سمك الفرع يقتصر على أما 250 نيوتن متر أو 500 نانومتر استخدام تيم التشغيل في 200 كيلوفولت أو 300 كيلو فولت، على التوالي. لأنه قد يكون سمك ميتوكندريا أكثر من 2 ميكرومتر، مقاطع المسلسل مطلوبة للحصول على كامل حجم عمليات إعادة البناء. ومع ذلك، استرداد عدد كاف من مقاطع المسلسل تمتد عضية أكملها تحديا تقنيا. تقليم الوجه كتلة تكون مسطحة قدر الإمكان بين قواعد شبه منحرف السماح لشبكة فتحه لاستيعاب المزيد من المقاطع وهكذا تغطي كميات أكبر. بالإضافة إلى ذلك، استخدام حلقة مثالية لأقسام رقيقة يزيد من معدل نجاح نقل المقاطع المسلسل إلى الشبكة.
يمكن إنجاز إلكترون المسلسل-قسم التصوير المقطعي مع المعدات الأساسية م القياسية. ومع ذلك، الأسلوب يحتوي على بعض التقييدات الحتمية التي تنشأ عن القيود التقنية. واحد أن المواد تفقد حتما بين مقاطع المسلسل، ترك ثغرات في عملية إعادة إعمار انضم. وثانيها هو قطعة أثرية آسفين المفقودة، التي تنشأ بسبب زوايا الميل المحدودة التي يمكن تحقيقها. يحدث هذا القيد لأنه لا يمكن تشغيل صاحب العينة في استدارة كاملة دون عرقلة شعاع الإلكترون. وعلى الرغم من هذه القيود، يوفر التصوير المقطعي الإلكترون المسلسل-القسم القرار كافية للكشف عن أولتراستروكتوري الخلوية وعضيه في 3D.
للتصوير بمقياس أصغر، هو التصوير المقطعي الإلكترون البرد تكنولوجيا ناشئة التي يمكن استخدامها للحصول على هيكل الجزيئات المجمعات والجمعيات في الموقع في القرار nm أو انغستروم الفرعية في تركيبة مع sub-تمجربهك 3من إعادة الإعمار. في هذا التطبيق، وهي ضعفت الخلايا بتمزيقها أو بواسطة شعاع أيون مركزة طحن تحت النتروجين السائل. وتجمع في توموجرامس تحت ظروف البرد حيث يتم الاحتفاظ بالهياكل الجزيئية قريبة من الدولة الأصلية دون التثبيت الكيميائي، أو الجفاف، أو تضمين. في الطرف الآخر من المقياس، لتحليل كميات كبيرة من الأنسجة على حساب القرار، الميكروسكوب الإلكتروني مسح الوجه كتلة المسلسل طريقة جذابة على الرغم من أنه يتطلب وجود صك محدد4.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الدراسات التي أجريت في لب م في معهد الخلوية والبيولوجيا أورجانيسميك ولب م cryo “سينيكا”، تايبيه، تايوان. العمل الذي أيده سينيكا ومعظم.
Materials
| vibrating blade microtome | Leica | VT1200S | Tissue sectioning |
| high-pressure freezer | Leica | EM HPM100 | Specimen preparation |
| freeze-substitution device | Leica | EM AFS2 | Specimen preparation |
| ultramicrotome | Leica | EM UC7 | Ultra-thin sectioning |
| dual-axis tomography holder | Fischione | Model 2040 | tomography collection |
| transmission electron microscope | FEI | Tecnai F20 | tomography collection |
| CCD | Gatan | UltraScan 1000 | tomography collection |
| Leginon | NRAMM/AMI | tomography collection | |
| IMOD | Boulder Laboratory for 3-D Electron Microscopy of Cells | Tomography reconstruction | |
| Avizo 3D | FEI | Tomography analysis | |
References
- Dahl, R., Staehelin, L. A. High-pressure freezing for the preservation of biological structure: theory and practice. J Electron Microsc Tech. 13 (3), 165-174 (1989).
- Sabatini, D. D., Bensch, K., Barrnett, R. J. Cytochemistry and electron microscopy. The preservation of cellular ultrastructure and enzymatic activity by aldehyde fixation. J Cell Biol. 17, 19-58 (1963).
- Rigort, A., et al. Micromachining tools and correlative approaches for cellular cryo-electron tomography. J Struct Biol. 172 (2), 169-179 (2010).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biol. 2 (11), e329 (2004).
- Lucic, V., Forster, F., Baumeister, W. Structural studies by electron tomography: from cells to molecules. Annu Rev Biochem. 74, 833-865 (2005).
- Soto, G. E., et al. Serial section electron tomography: a method for three-dimensional reconstruction of large structures. Neuroimage. 1 (3), 230-243 (1994).
- Jiang, Y. F., et al. Electron tomographic analysis reveals ultrastructural features of mitochondrial cristae architecture which reflect energetic state and aging. SciRep. 7, 45474 (2017).
- Cogliati, S., Enriquez, J. A., Scorrano, L. Mitochondrial Cristae: Where Beauty Meets Functionality. TrendsBiochemSci. 41 (3), 261-273 (2016).
- Friedman, J. R., Nunnari, J. Mitochondrial form and function. Nature. 505 (7483), 335-343 (2014).
- Suloway, C., et al. Fully automated, sequential tilt-series acquisition with Leginon. J Struct Biol. 167 (1), 11-18 (2009).
- Mastronarde, D. N., Held, S. R. Automated tilt series alignment and tomographic reconstruction in IMOD. J Struct Biol. 197 (2), 102-113 (2017).
