3D mitochondrialen Ultrastruktur von Drosophila indirekte Flüge Muskel von Serial-Abschnitt Elektron Tomographie aufgedeckt
Summary
In diesem Protokoll demonstrieren wir die Anwendung der seriell-Abschnitt Elektron Tomographie, mitochondriale Struktur in Drosophila indirekte Flüge Muskel aufzuklären.
Abstract
Mitochondrien sind zelluläre Kraftpakete, die produzieren ATP, Lipide und Metaboliten sowie Kalzium-Homöostase und Zelle Tod zu regulieren. Die einzigartige Cristae-reiche Doppelmembran Ultrastruktur von dieser Organellen ist elegant angeordnet, um mehrere Funktionen durchzuführen, durch die Partitionierung Biomoleküle. Mitochondrialen Ultrastruktur ist eng mit verschiedenen Funktionen; die feinen Details dieser Struktur-Funktions-Beziehungen sind jedoch erst am Anfang beschrieben werden. Hier zeigen wir die Anwendung der seriell-Abschnitt Elektron Tomographie, mitochondriale Struktur in Drosophila indirekte Flüge Muskel aufzuklären. Seriell-Abschnitt Elektron Tomographie kann Zellstruktur in drei Dimensionen zu studieren angepasst.
Introduction
Elektronenmikroskopie ist ein wertvolles Instrument zur Untersuchung der strukturellen Kontext der subzellulären Baugruppen und Organellen, die zelluläre Prozesse ausführen. Methoden wurden entwickelt, um die Ultrastruktur von Geweben oder Zellen entweder durch chemische Fixierung mit Aldehyden zu erhalten oder durch hohen Druck Einfrieren (HPF) gefolgt von freeze Substitution (FS)1,2. Die eingebetteten Proben Blöcke können dann geschnitten, gebeizt und mit einem Transmissionselektronenmikroskop (TEM) beobachtet. Die HPF-Probe konnte auch unter Cryo-Zustand, z. B. durch Cryo-schneiden oder fokussierten Ionenstrahl (FIB) Fräsen und beobachtet von Cryo-EM3,4verarbeitet werden.
Obwohl dünn-Sektion EM morphologische aufschlussreiche Einblicke bietet, können die resultierenden 2D Bilder nur die Ultrastruktur der einen bestimmten Querschnitt zeigen. Wie die Ultrastruktur in ein 3D Volumen anordnet bleibt verdeckt. Um zellulären Ultrastruktur dreidimensional sichtbar zu machen, wurde eine Elektron Tomographie Methode entwickelt, wo Tilt Bilderserie erworben und zurück projiziert, um eine tomographische Rekonstruktion5 (Abbildung 1) zu generieren. Eine doppelte Tilt-Reihe kann gesammelt werden, durch die Probe 90° drehen und eine zweite Tilt-Serie zu erwerben. Dies minimiert fehlt-Wedge Artefakte, die ergeben sich aus der begrenzten Probenahme Winkel und Auflösung der Tomogramm verbessert.
Hier beschreiben wir die Anwendung der seriell-Abschnitt Elektron Tomographie studieren mitochondrialen Ultrastruktur von Drosophila indirekte Flüge Muskel (IFM)6,7,8,9 . Um 3D Rekonstruktionen für gesamte Mitochondrien (ca. 2,5 µm dicken) zu erhalten, wurden Serienschnitte von Drosophila IFM Gewebe Blöcke erhalten. Schichtbilder der einzelnen Abschnitte wurden einzeln mit automatischer Datenerfassungs-Software gesammelt. Tomographische Rekonstruktionen wurden generiert und serielle Schichtbilder schlossen mit dem IMOD Paket, einem rekonstruierten Volumen von eine gesamte Mitochondrium zu erhalten. Die verbundenen Schichtbilder wurden von 3D Software analysiert. Die Dichte der Mitochondrien Cristae wurden segmentiert, um einem Segmentierungsmodell zu generieren, die die Organisation in drei Dimensionen offenbart.
Protocol
Representative Results
Discussion
In diesem Protokoll beschreiben wir einen optimierten Workflow für die Anwendung von seriell-Abschnitt Elektron Tomographie zur 3D mitochondrialen Ultrastruktur von Drosophila indirekte Flüge Muskel zu studieren. Erhaltung der Ultrastruktur in der Probe ist die größte technische Herausforderung für diese Art der Analyse. Um am besten die Ultrastruktur zwei methodische zu bewahren wurden Schritte enthalten. Erstens wurde Gewebe gesampelt, durch Schneiden mit vibrierender Klinge Mikrotom um die Gewebearchitektur so weit wie möglich zu halten. Zweitens wurde ein HPF/FS-Protokoll optimiert, um Organelle Ultrastruktur während der Vorbereitung des eingebetteten Proben Blöcke zu bewahren. Proben wurden unter hohem Druck, eingefroren, senkt den Gefrierpunkt des Wassers und reduziert die Bildung von Eiskristallen, die Ultrastruktur1beschädigen. Exemplare, die so dick wie 0,1 mm augenblicklich verglast sein kann, und dann einfrieren, Ersatz um Probe Blöcke für EM-Analyse zu generieren unterzogen. Die verbesserte Erhaltung der Ultrastruktur von HPF/FS wurde festgestellt, wenn im Vergleich zu chemischen Fixierung Methoden. Mit dieser Serie von Schritten für die Probenvorbereitung, wurde Erhaltung der mitochondrialen doppelte Membranen und Cristae Membranen erheblich verbessert.
Schnittserien der Probe zu erhalten, ist der schwierigste Schritt des Verfahrens. Da der Elektronenstrahl Durchdringungskraft begrenzt hat, die Dicke des Abschnitts beschränkt sich auf entweder 250 nm oder 500 nm mit einem TEM Betrieb bei 200 kV oder 300 kV, beziehungsweise. Da die Dicke der ein Mitochondrium möglicherweise mehr als 2 µm, Serienschnitte müssen volle Lautstärke Rekonstruktionen zu erhalten. Wiederherstellung einer ausreichenden Zahl von Schnittserien umfassen eine ganze Organelle ist jedoch eine technische Herausforderung. Das Block-Gesicht so flach wie möglich zwischen den Basen des Trapezes zu trimmen können eine Slot-Raster, um Platz für weitere Abschnitte und deckt damit größere Mengen. Darüber hinaus erhöht mit einer perfekten Schleife für Dünnschliffe die Erfolgsquote der Schnittserien an das Stromnetz zu übertragen.
Seriell-Abschnitt Elektron Tomographie kann mit Standardausrüstung EM Kern erreicht werden. Die Methode hat jedoch einige unvermeidlichen Einschränkungen, die durch technische Zwänge entstehen. Einer ist, dass Material unweigerlich verloren zwischen Serienschnitte, so dass Lücken in den verbundenen Wiederaufbau. Zweitens ist das fehlende Keil Artefakt, die aufgrund der begrenzten Neigungswinkel entsteht, die erreichbar sind. Diese Einschränkung tritt auf, weil der Probenhalter in eine volle Umdrehung eingeschaltet werden kann, ohne zu blockieren den Elektronenstrahl. Trotz dieser Einschränkungen bietet Serien-Abschnitt Elektron Tomographie ausreichenden Auflösung, Mobilfunk- und Organelle Ultrastruktur in 3D zu offenbaren.
Für die kleineren Maßstab Bildgebung ist Cryo-Elektron Tomographie eine neue Technologie, die verwendet werden, um die Struktur der makromolekularen komplexe und Baugruppen in Situ in nm oder Sub Ångström Auflösung in Kombination mit Sub-tomographische zu erhalten Umbau3. In dieser Anwendung sind die Zellen durch Schneiden oder Fräsen unter flüssigem Stickstoff fokussierten Ionenstrahl ausgedünnt. Die Schichtbilder werden unter Cryo-Bedingungen gesammelt wo sind molekulare Strukturen in der Nähe der nativen Zustand ohne chemische Fixierung, Austrocknung oder einbetten erhalten. Am anderen Ende der Skala um große Gewebe auf Kosten der Auflösung, analysieren ist Rasterelektronenmikroskopie serielle Block-Gesicht eine ansprechende Modalität, obwohl es ein spezifisches Instrument4erfordert.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Untersuchungen wurden in der EM-Kern am Institut für Zell- und Organismische Biologie und die Cryo-EM Kern der Academia Sinica, Taipei, Taiwan durchgeführt. Die Arbeit wurde von der Academia Sinica und die meisten unterstützt.
Materials
| vibrating blade microtome | Leica | VT1200S | Tissue sectioning |
| high-pressure freezer | Leica | EM HPM100 | Specimen preparation |
| freeze-substitution device | Leica | EM AFS2 | Specimen preparation |
| ultramicrotome | Leica | EM UC7 | Ultra-thin sectioning |
| dual-axis tomography holder | Fischione | Model 2040 | tomography collection |
| transmission electron microscope | FEI | Tecnai F20 | tomography collection |
| CCD | Gatan | UltraScan 1000 | tomography collection |
| Leginon | NRAMM/AMI | tomography collection | |
| IMOD | Boulder Laboratory for 3-D Electron Microscopy of Cells | Tomography reconstruction | |
| Avizo 3D | FEI | Tomography analysis | |
References
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