Bir RANKL tabanlı Osteoklast kültür tahlil, fare mTORC1 Osteoklast oluşumunda rol araştırmak için ilik
Summary
Bu el yazması bir iletişim kuralına izole etmek ve kültür Osteoklastlar vitro fare kemik iliği ve rapamycin karmaşık 1 Osteoklast oluşumunda memeli/mekanik hedef rolü çalışmaya açıklar.
Abstract
Osteoklastlar vardır benzersiz kemik-resorbing kemik iliği monosit/makrofaj soyundan hücre. Osteoklastlar disfonksiyon kemik metabolik hastalıkları, osteoporoz da dahil olmak üzere bir dizi neden olabilir. Patolojik kemik kayıplarının önlenmesi için ilaç hedefleri geliştirmek için hangi precursors Osteoklastlar ayırt mekanizmaları anlaşılması gerekir. Yeteneği yalıtmak ve çok sayıda Osteoklastlar vitro kültür Osteoklast ayrımında belirli genlere rolünün belirlemede önemlidir. İnactivation rapamycin karmaşık 1 (TORC1) Osteoklastlar içinde memeli/mekanik hedef Osteoklast kaç azaltın ve kemik kütlesi artırmak; Ancak, temel mekanizmaları daha fazla çalışma gerektirir. Bu da çalışmanın, ayırmak ve fare kemik iliği dan Osteoklastlar kültür ve mTORC1 inactivation Osteoklast oluşumu üzerine etkisi çalışmaya RANKL tabanlı bir protokol açıklanmıştır. Bu iletişim kuralı, genellikle bir hafta içinde çok sayıda dev Osteoklastlar, başarıyla sonuçlandı. Raptor silinmesiyle Osteoklast oluşumu Engelli ve o mTORC1 Osteoklast oluşumu için kritik olduğunu belirten salgı tartarat dayanıklı asit fosfataz aktivitesini azalmıştır.
Introduction
Kemik değişen bir organdır ve dokusunu ve hayatı boyunca Osteoklastlar tarafından yenilenmiş. Osteoklastlar mineralize matris rezorpsiyonu için sorumlu ve dokusunu sentez ve yeni kemik matrisler1salgılar. Kemik rezorpsiyonu ve kemik oluşumu arasındaki dengeyi kemik bakım da dahil olmak üzere Kemik sağlığı için önemlidir kütle ve stimülasyon ve yaralanma yanıt. Bu denge bozulur, bir dizi metabolik kemik hastalıkları, Osteoporoz ve periodontal hastalıkları da dahil olmak üzere meydana gelebilir. Bu hastalıklar, kemik dokusunu2,3kapasite şekillendirme mediatörlerin kemik rezorpsiyonu kaynaklanan kemik kayıplarının aşıyor. Böylece, osteoporoz gibi iskelet bozuklukları tedavisinde ilaç hedefleri geliştirmek için üretimi ve Biyoloji Osteoklastlar4anlamak önemlidir.
Osteoklastlar benzersiz dev multinucleated hücreleri, veya kemik yüzeye yakın bulunan ve monosit/makrofaj aile1‘ e ait. Ibbotson K. J. vd. Osteoklast benzeri hücreler vitro ile 1,25-dihidroksi-vitamin D35içeren ortam oluşturmak için bir yöntem bildirdi. Makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF) ve reseptör aktivatör nükleer faktör-κ B ligand (RANKL) için tanımlayıcısı Osteoklast oluşumu temel faktörler olarak osteoclastogenesis içinde vitro verimliliğini önemli ölçüde artmıştır 1 , 6 , 7. Kültür Osteoklastlar vitro yeteneği anlayışımız oluşturma ve düzenleme, Osteoklastlar geliştirdi.
Memeli/mekanik hedef iki yapısal ve işlevsel olarak ayrı kompleksleri, yani mTORC1 ve mTORC28,9‘ rapamycin (mTOR) fonksiyonların. İki çok protein kompleksleri onların farklı bileşenleri ve aşağı akım yüzeylerde nedeniyle birbirinden farklıdır. mTORC2 içerirken, rapamycin-duyarlı arkadaşı mTOR (Rictor)9mTORC1 mTOR (Raptor), benzersiz düzenleyici ilişkili protein içerir. mTORC1 entegre ve hücre büyümesi, yayılmasını önleme ve farklılaşma düzenleyen önemli sinyalleri iletmek. Son zamanlarda, biz bu mTORC1 mTORC1 Osteoklastlar10devre dışı bırakabilirsiniz için Raptor silinmesiyle tarafından katabolik kemik rezorpsiyonu ağ içinde önemli bir rol oynar gösterdi. Ancak, temel mekanizmaları daha fazla çalışma gerektirir. Bu da çalışmanın, Osteoklastlar kemik iliği türevi makrofajlar vahşi-tipi (WT) ve Ctsk Rap fareler (BMMs) oluşturmak ve mTORC1 inactivation Osteoklast üzerindeki etkisini incelemek için osteoclastogenic RANKL tabanlı yöntemi kullanıldı oluşumu.
Protocol
Representative Results
Discussion
Osteoclastogenic tahlil yalıtmak ve Osteoklastlar vitro12,13kültür için en çok kullanılan yöntemdir. Ise birkaç RANKL tabanlı Osteoklast indüksiyon açıklanan13,14,15olabilirdi, bu da çalışmanın bir iletişim kuralı önceki yöntemleri üzerinde temel bazı değişikliklerle nitelendirdi.
Önceki çalışmada, BMMs hem…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. Minghan Tong ve S. Kato yazarlar nazikçe sağlayan reaktifler ve fareler için teşekkür ederiz. Biz yararlı tartışmalar Zou laboratuvar üyeleri teşekkür ederim. Bu eser kısmen hibe tarafından desteklenmiştir 973 Çin Bakanlığı bilim ve Teknoloji (çoğu) [2014CB964704 2015CB964503], 9 insanların Hastanesi, Shanghai Jiao Tong Üniversitesi Tıp Fakültesi klinik araştırma programı Program. Hücre biyolojisi ve çekirdek tesis Kimya Biyoloji, moleküler hücre bilim, Shanghai Enstitüsü biyokimyası ve hücre biyolojisi, Çin Bilimler Akademisi mükemmelliği CAS merkezi çekirdek tesis yardım için teşekkür ederiz.
Materials
| Raptorfl/fl mice | The Jackson Laboratory | 013188 | |
| Ctsk-cre mice | a gift from S. Kato, University of Tokyo, Tokyo, Japan | ||
| α-MEM | Corning | 10-022-CVR | |
| Glutamine | Gibico | 25030081 | |
| Penicillin streptomycin | Gibico | 15140122 | |
| Fetal calf serum | BioInd | 04-001-1A | |
| Recombinant mouse M-CSF protein | R&D | Q3U4F9 | |
| Recombinant mouse RANKL protein | R&D | Q3TWY5 | |
| RBC lysis buffer | Beyotime | C3702 | |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | 302643 | |
| Acetone | Shanghai Chemical Co. Ltd. | ||
| Citrate solution | Sigma-Aldrich | 915 | |
| Formaldehyde solution | Shanghai Chemical Co. Ltd. | ||
| Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit | Sigma-Aldrich | 387A-1KT | |
| Fast Garnet GBC Base solution | Sigma-Aldrich | 3872 | |
| Sodium Nitrite Solution | Sigma-Aldrich | 914 | |
| Naphthol AS-BI Phosphate Solution | Sigma-Aldrich | 3871 | |
| Acetate solution | Sigma-Aldrich | 3863 | |
| Tartrate solution | Sigma-Aldrich | 3873 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Corning | 21-031-CVR | |
| L-tartaric acid | Sigma-Aldrich | 251380 | |
| Sodium tartrate dibasic dehydrate | Sigma-Aldrich | s4797 | |
| Glycine | Shanghai Chemical Co. Ltd. | ||
| MgCl2 | Shanghai Chemical Co. Ltd. | ||
| ZnCl2 | Shanghai Chemical Co. Ltd. | ||
| NaOH | Shanghai Chemical Co. Ltd. | ||
| Phosphatase substrate | Sigma-Aldrich | P4744 | |
| anti-Raptor | Cell Signaling Technology | 2280 | |
| anti-P-ribosomal protein S6 (S235/236) | Cell Signaling Technology | 2317 | |
| anti-ribosomal protein S6 | Cell Signaling Technology | 2211 | |
| anti-β-actin | Santa Cruz Biotechnology | sc-130300 | |
| 37% formaldehyde | Xilong scientific | ||
| polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane | Bio-Rad | ||
| Western Chemiluminescent HRP Substrate (ECL) | Millipore | 00000367MSDS | |
| IX71 | Olympus | ||
| Envision | Perkin Elmer | ||
| 0.45-mm Syringe | |||
| Scissor | |||
| Mosquito forcep |
References
- Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).
- Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nature Genetics. 33, 245-254 (2003).
- Feng, X., McDonald, J. M. Disorders of bone remodeling. Annu Rev Pathol. 6, 121-145 (2011).
- Boyce, B. F. Advances in osteoclast biology reveal potential new drug targets and new roles for osteoclasts. J Bone Miner Res. 28 (4), 711-722 (2013).
- Ibbotson, K. J., Roodman, G. D., McManus, L. M., Mundy, G. R. Identification and characterization of osteoclast-like cells and their progenitors in cultures of feline marrow mononuclear cells. J Cell Biol. 99 (2), 471-480 (1984).
- Lacey, D. L., et al. Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation. Cell. 93 (2), 165-176 (1998).
- Wong, B. R., et al. TRANCE is a novel ligand of the tumor necrosis factor receptor family that activates c-Jun N-terminal kinase in T cells. J Biol Chem. 272 (40), 25190-25194 (1997).
- Zoncu, R., Efeyan, A., Sabatini, D. M. mTOR: from growth signal integration to cancer, diabetes and ageing. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (1), 21-35 (2011).
- Bhaskar, P. T., Hay, N. The two TORCs and Akt. Dev Cell. 12 (4), 487-502 (2007).
- Dai, Q., et al. Inactivation of Regulatory-associated Protein of mTOR (Raptor)/Mammalian Target of Rapamycin Complex 1 (mTORC1) Signaling in Osteoclasts Increases Bone Mass by Inhibiting Osteoclast Differentiation in Mice. J Biol Chem. 292 (1), 196-204 (2017).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. . Molecular cloning: a laboratory manual. , (1989).
- Weischenfeldt, J., Porse, B. Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications. CSH Protoc. 2008, (2008).
- Bradley, E. W., Oursler, M. J. Osteoclast culture and resorption assays. Methods Mol Biol. 455, 19-35 (2008).
- Tevlin, R., et al. Osteoclast derivation from mouse bone marrow. J Vis Exp. (93), e52056 (2014).
- Xing, L., Boyce, B. F. RANKL-based osteoclastogenic assays from murine bone marrow cells. Methods Mol Biol. 1130, 307-313 (2014).
- Hsu, H., et al. Tumor necrosis factor receptor family member RANK mediates osteoclast differentiation and activation induced by osteoprotegerin ligand. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (7), 3540-3545 (1999).
- Underwood, J. C. From where comes the osteoclast?. J Pathol. 144 (4), 225-226 (1984).
- Wein, M. N., et al. Control of bone resorption in mice by Schnurri-3. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (21), 8173-8178 (2012).
