على أساس رانكل "اوستيوكلاست الثقافة المقايسة للماوس نخاع العظام" التحقيق في دور mTORC1 في "تشكيل اوستيوكلاست"
Summary
ويصف هذه المخطوطة بروتوكولا لعزل والثقافة الآكلة في المختبر من الماوس نخاع العظام، ودراسة دور هدف ربمسن 1 المعقدة في تشكيل اوستيوكلاست/آليا إلى الثدييات.
Abstract
الآكلة فريدة من نوعها في ريسوربينج العظام الخلايا التي تميز من نسب الوحيدات/بلعم نخاع العظام. قد يؤدي إلى اختلال وظيفي للأكلة سلسلة من الأمراض الأيضية العظام، بما في ذلك مرض هشاشة العظام. على وضع أهداف الصيدلية لمنع فقدان كتلة العظم المرضية، يجب أن يكون مفهوما أن الآليات التي تميز الآكلة من السلائف. القدرة على عزل والثقافة عددا كبيرا من الآكلة في المختبر أمر بالغ الأهمية من أجل تحديد دور جينات محددة في تمايز اوستيوكلاست. يمكن إنقاص عدد اوستيوكلاست المنظمة المستهدفة/آليا إلى الثدييات من ربمسن 1 معقدة (TORC1) في الآكلة وزيادة كتلة العظام؛ غير أن الآليات الأساسية التي تتطلب المزيد من الدراسة. ويرد في هذه الدراسة، بروتوكول المستندة إلى رانكل لعزل والثقافة الآكلة من نخاع العظام الماوس ودراسة تأثير المنظمة mTORC1 على تشكيل اوستيوكلاست. وأسفر هذا البروتوكول بنجاح عدد كبير من الآكلة العملاقة، عادة خلال أسبوع واحد. ضعف تشكيل اوستيوكلاست حذف رابتور وتناقص نشاط الافرازية الفوسفاتيز الحمضي طرطرات المقاوم، مشيراً إلى أن mTORC1 أمر حاسم لتشكيل اوستيوكلاست.
Introduction
العظم هو هيئة دائمة التغير ويتم تشكيلها بواسطة خلايا الاوستيوبلاستس والأكلة طوال الحياة. الآكلة المسؤولة عن ارتشاف مصفوفة غضاريف وخلايا الاوستيوبلاستس توليف وتفرز مصفوفات العظام الجديدة1. التوازن بين ارتشاف العظام وتكوين العظام حاسم بالنسبة لصحة العظام بما في ذلك الحفاظ على العظام الجماهيري والاستجابة للتحفيز والإصابة. إذا تعطل هذا التوازن، قد تحدث سلسلة من أمراض العظام الأيضية، بما في ذلك مرض هشاشة العظام وأمراض اللثة. في هذه الأمراض، ويتجاوز فقدان كتلة العظام الناتجة عن ارتشاف العظام أوستيوكلاستيك العظام تشكيل قدرة خلايا الاوستيوبلاستس2،3. وهكذا، من أجل تطوير أهداف الأدوية لعلاج أمراض الهيكل العظمى مثل هشاشة العظام، أنها حاسمة لفهم جيل وعلم الأحياء من الآكلة4.
الآكلة هي خلايا مولتينوكليتيد العملاقة فريد من نوعه يقع في أو بالقرب من سطح العظام، وتنتمي إلى الأسرة بلعم الوحيدات/1. ج. ك. Ibbotson et al. وذكرت وسيلة لتوليد اوستيوكلاست-مثل الخلايا في المختبر مع المتوسطة التي تحتوي على 1, 25-ديهيدروكسي-فيتامين D35. تحديد عامل تحفيز مستعمرة بلعم (م-CSF) والمنشط مستقبلات ليجند ب النووية عامل-κ (رانكل) كعوامل أساسية في تشكيل اوستيوكلاست زاد زيادة كبيرة كفاءة أوستيوكلاستوجينيسيس في المختبر 1 , 6 , 7-القدرة على ثقافة الآكلة في المختبر قد تحسن فهمنا لتوليد وتنظيم الآكلة.
الهدف/آليا إلى الثدييات الوظائف ربمسن (mTOR) في اثنين من المجمعات المتميزة هيكلياً ووظيفيا، وهما mTORC1 و mTORC28،9. مجمعين البروتين المتعددة متميزة عن بعضها البعض بسبب مكوناتها المختلفة وركائز المتلقين للمعلومات. mTORC1 يحتوي على بروتين التنظيمية المرتبطة فريدة من mTOR (رابتور)، بينما يحتوي mTORC2 على رفيق ربمسن غير متحسسة من mTOR (Rictor)9. ويمكنك دمج mTORC1 وإرسال إشارات هامة لتنظيم نمو الخلايا وانتشارها والتمايز. في الآونة الأخيرة، أثبتنا أن mTORC1 دوراً رئيسيا في الشبكة لارتشاف العظم تقويضي بحذف رابتور لإلغاء تنشيط mTORC1 في الآكلة10. غير أن الآليات الأساسية التي تتطلب المزيد من الدراسة. في هذه الدراسة، استخدمت أسلوب المستندة إلى رانكل أوستيوكلاستوجينيك لتوليد الآكلة من المشتقة من نخاع العظم الضامة (بنغلادش) البرية من نوع (WT) والفئران الرابكتسك ، ودراسة تأثير المنظمة mTORC1 في اوستيوكلاست تشكيل.
Protocol
Representative Results
Discussion
تحليل أوستيوكلاستوجينيك هو الأسلوب الأكثر استخداماً لعزل والثقافة الآكلة في المختبر12،13. بينما عدة على أساس رانكل اوستيوكلاست الحث قد وصف13،،من1415، وصف هذه الدراسة بروتوكولا مع بعض التعديلات استناداً…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون الدكتور Minghan تونغ وكاتو س. يرجى توفير الكواشف والفئران. ونشكر أعضاء المختبر زو لإجراء مناقشات مفيدة. هذا العمل كان تدعمها جزئيا في المنح من 973 برنامج من الوزارة الصينية للعلوم والتكنولوجيا (معظم) [2014CB964704 و 2015CB964503]، “برنامج البحوث السريرية” لمستشفى الشعب التاسع، “شانغهاي جياو تونغ جامعة كلية الطب”. شكرا لمساعدة “المرافق الأساسية” لبيولوجيا الخلايا والمرافق الأساسية “علم الأحياء الكيميائية”، والأكاديمية الصينية للعلوم في مركز للتفوق في مجال العلوم الخلية الجزيئية، معهد شانغهاي للكيمياء الحيوية وبيولوجيا الخلايا، الأكاديمية الصينية للعلوم.
Materials
| Raptorfl/fl mice | The Jackson Laboratory | 013188 | |
| Ctsk-cre mice | a gift from S. Kato, University of Tokyo, Tokyo, Japan | ||
| α-MEM | Corning | 10-022-CVR | |
| Glutamine | Gibico | 25030081 | |
| Penicillin streptomycin | Gibico | 15140122 | |
| Fetal calf serum | BioInd | 04-001-1A | |
| Recombinant mouse M-CSF protein | R&D | Q3U4F9 | |
| Recombinant mouse RANKL protein | R&D | Q3TWY5 | |
| RBC lysis buffer | Beyotime | C3702 | |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | 302643 | |
| Acetone | Shanghai Chemical Co. Ltd. | ||
| Citrate solution | Sigma-Aldrich | 915 | |
| Formaldehyde solution | Shanghai Chemical Co. Ltd. | ||
| Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit | Sigma-Aldrich | 387A-1KT | |
| Fast Garnet GBC Base solution | Sigma-Aldrich | 3872 | |
| Sodium Nitrite Solution | Sigma-Aldrich | 914 | |
| Naphthol AS-BI Phosphate Solution | Sigma-Aldrich | 3871 | |
| Acetate solution | Sigma-Aldrich | 3863 | |
| Tartrate solution | Sigma-Aldrich | 3873 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Corning | 21-031-CVR | |
| L-tartaric acid | Sigma-Aldrich | 251380 | |
| Sodium tartrate dibasic dehydrate | Sigma-Aldrich | s4797 | |
| Glycine | Shanghai Chemical Co. Ltd. | ||
| MgCl2 | Shanghai Chemical Co. Ltd. | ||
| ZnCl2 | Shanghai Chemical Co. Ltd. | ||
| NaOH | Shanghai Chemical Co. Ltd. | ||
| Phosphatase substrate | Sigma-Aldrich | P4744 | |
| anti-Raptor | Cell Signaling Technology | 2280 | |
| anti-P-ribosomal protein S6 (S235/236) | Cell Signaling Technology | 2317 | |
| anti-ribosomal protein S6 | Cell Signaling Technology | 2211 | |
| anti-β-actin | Santa Cruz Biotechnology | sc-130300 | |
| 37% formaldehyde | Xilong scientific | ||
| polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane | Bio-Rad | ||
| Western Chemiluminescent HRP Substrate (ECL) | Millipore | 00000367MSDS | |
| IX71 | Olympus | ||
| Envision | Perkin Elmer | ||
| 0.45-mm Syringe | |||
| Scissor | |||
| Mosquito forcep |
References
- Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).
- Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nature Genetics. 33, 245-254 (2003).
- Feng, X., McDonald, J. M. Disorders of bone remodeling. Annu Rev Pathol. 6, 121-145 (2011).
- Boyce, B. F. Advances in osteoclast biology reveal potential new drug targets and new roles for osteoclasts. J Bone Miner Res. 28 (4), 711-722 (2013).
- Ibbotson, K. J., Roodman, G. D., McManus, L. M., Mundy, G. R. Identification and characterization of osteoclast-like cells and their progenitors in cultures of feline marrow mononuclear cells. J Cell Biol. 99 (2), 471-480 (1984).
- Lacey, D. L., et al. Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation. Cell. 93 (2), 165-176 (1998).
- Wong, B. R., et al. TRANCE is a novel ligand of the tumor necrosis factor receptor family that activates c-Jun N-terminal kinase in T cells. J Biol Chem. 272 (40), 25190-25194 (1997).
- Zoncu, R., Efeyan, A., Sabatini, D. M. mTOR: from growth signal integration to cancer, diabetes and ageing. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (1), 21-35 (2011).
- Bhaskar, P. T., Hay, N. The two TORCs and Akt. Dev Cell. 12 (4), 487-502 (2007).
- Dai, Q., et al. Inactivation of Regulatory-associated Protein of mTOR (Raptor)/Mammalian Target of Rapamycin Complex 1 (mTORC1) Signaling in Osteoclasts Increases Bone Mass by Inhibiting Osteoclast Differentiation in Mice. J Biol Chem. 292 (1), 196-204 (2017).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. . Molecular cloning: a laboratory manual. , (1989).
- Weischenfeldt, J., Porse, B. Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications. CSH Protoc. 2008, (2008).
- Bradley, E. W., Oursler, M. J. Osteoclast culture and resorption assays. Methods Mol Biol. 455, 19-35 (2008).
- Tevlin, R., et al. Osteoclast derivation from mouse bone marrow. J Vis Exp. (93), e52056 (2014).
- Xing, L., Boyce, B. F. RANKL-based osteoclastogenic assays from murine bone marrow cells. Methods Mol Biol. 1130, 307-313 (2014).
- Hsu, H., et al. Tumor necrosis factor receptor family member RANK mediates osteoclast differentiation and activation induced by osteoprotegerin ligand. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (7), 3540-3545 (1999).
- Underwood, J. C. From where comes the osteoclast?. J Pathol. 144 (4), 225-226 (1984).
- Wein, M. N., et al. Control of bone resorption in mice by Schnurri-3. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (21), 8173-8178 (2012).
