Een RANKL gebaseerde Osteoclast cultuur Assay van muis beenmerg te onderzoeken van de rol van mTORC1 in Osteoclast vorming
Summary
Dit manuscript wordt beschreven van een protocol bij isolaat en cultuur osteoclasten in vitro uit beenmerg van de muis, en te bestuderen van de rol van het zoogdier/mechanistische doelwit van rapamycin complexe 1 in osteoclast vorming.
Abstract
Osteoclasten zijn unieke bot-resorbeerbare cellen die van de bloedlijn monocyt/macrophage van beenmerg onderscheiden. Dysfunctie van osteoclasten kan resulteren in een reeks van bot metabole ziekten, met inbegrip van osteoporose. Ontwikkeling van farmaceutische doelstellingen voor de preventie van pathologische massa botverlies, moeten de mechanismen waarmee osteoclasten van precursoren onderscheiden worden begrepen. De mogelijkheid om te isoleren en een groot aantal osteoclasten in vitro cultuur is van cruciaal belang om te bepalen van de rol van specifieke genen bij osteoclast differentiatie. Inactivering van het zoogdier/mechanistische doelwit van rapamycin complexe 1 (TORC1) in osteoclasten kan verminderen osteoclast nummer en verhoging van de botmassa; echter de onderliggende mechanismen nader moeten worden onderzocht. In de huidige studie, wordt een RANKL gebaseerde protocol cultuur osteoclasten uit beenmerg van de muis te isoleren en te bestuderen of de invloed van mTORC1 inactivatie op osteoclast vorming beschreven. Dit protocol met succes geleid tot een groot aantal reus osteoclasten, meestal binnen een week. Schrapping van de Raptor verminderde osteoclast vorming en daalde de activiteit van secretoire tartraat-resistente zure fosfatase, die aangeeft dat mTORC1 is van cruciaal belang voor osteoclast vorming.
Introduction
Bot is een orgaan steeds veranderende en is gerenoveerd door botcellen en osteoclasten gedurende het hele leven. Osteoclasten zijn verantwoordelijk voor gemineraliseerde matrix resorptie en botcellen synthetiseren en afscheiden van nieuw bot matrices1. Het evenwicht tussen resorptie van het been en been vorming is van cruciaal belang voor de gezondheid van de botten met inbegrip van onderhoud van bot massa en respons op stimulatie en schade. Als dit evenwicht is verstoord, kan een reeks van metabole ziekten bot optreden, met inbegrip van osteoporose en parodontale ziekten. In deze ziekten overschrijdt massale botverlies als gevolg van osteoclastic bot resorptie het bot vormen capaciteit van botcellen2,3. Het is dus, teneinde farmaceutische doelstellingen voor de behandeling van skeletstoornissen zoals osteoporose, kritiek te begrijpen van de generatie en de biologie van osteoclasten4.
Osteoclasten zijn unieke giant multinucleaire cellen zich op of in de buurt van het oppervlak van bot en behoren tot de familie van monocyt/macrofaag1. Ibbotson K. J. et al. een methode voor het genereren van osteoclast-achtige cellen in vitro met medium met 1,25-dihydroxy-vitamine D35gemeld. De identificatie van macrofaag-kolonie stimulerende factor (M-CSF) en receptor activator voor nuclear factor-Kappa B ligand (RANKL) als essentiële factoren van osteoclast formatie is sterk toegenomen de efficiëntie van de osteoclastogenesis in vitro 1 , 6 , 7. de mogelijkheid om cultuur osteoclasten in vitro verbeterd ons begrip van de generatie en regulering van de osteoclasten.
Het zoogdier/mechanistische doel van rapamycin (mTOR) functies in twee structureel en functioneel verschillende complexen, namelijk mTORC1 en mTORC28,9. De twee multi eiwitcomplexen zijn verschillend van elkaar als gevolg van hun verschillende componenten en de stroomafwaartse substraten. mTORC1 bevat de unieke regelgevende-geassocieerde proteïne van mTOR (Raptor), terwijl mTORC2 de rapamycin-ongevoelig metgezel van mTOR (Rictor)9 bevat. mTORC1 kan integreren en zenden belangrijke signalen voor het regelen van de celgroei, proliferatie en differentiatie. Onlangs, we laten zien dat mTORC1 speelt een sleutelrol in het netwerk van katabole bot resorptie door schrapping van de Raptor naar de inactivering van mTORC1 in de osteoclasten10. Echter de onderliggende mechanismen nader moeten worden onderzocht. In de huidige studie, werd een RANKL gebaseerde osteoclastogenic-methode gebruikt voor het genereren van osteoclasten uit beenmerg-afgeleide macrofagen (BMMs) van wild-type (WT) en RapCtsk muizen, en te bestuderen van de invloed van mTORC1 inactivatie op osteoclast vorming.
Protocol
Representative Results
Discussion
De bepaling van de osteoclastogenic is de wijdst gebruikte methode cultuur osteoclasten in vitro12,13te isoleren. Terwijl verscheidene RANKL gebaseerde osteoclast inducties beschreven13,14,15 zijn, wordt in de huidige studie een protocol met enkele aanpassingen op basis van de bovenstaande methoden beschreven.
In de vorige studie, war…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken Dr. Minghan Tong en S. Kato vriendelijk bieden reagentia en muizen. Wij danken de leden van de lab Zou voor nuttige discussies. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door subsidies van 973 Program van het Chinese ministerie van wetenschap en technologie (MOST) [2014CB964704 en 2015CB964503], klinische Research Program van 9e People’s Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine. Bedankt voor de hulp van Core faciliteit voor Core faciliteit voor chemische biologie, celbiologie en CAS Center for Excellence in de moleculaire cel Science, Shanghai Instituut voor Biochemie en celbiologie, Chinese Academie van Wetenschappen.
Materials
| Raptorfl/fl mice | The Jackson Laboratory | 013188 | |
| Ctsk-cre mice | a gift from S. Kato, University of Tokyo, Tokyo, Japan | ||
| α-MEM | Corning | 10-022-CVR | |
| Glutamine | Gibico | 25030081 | |
| Penicillin streptomycin | Gibico | 15140122 | |
| Fetal calf serum | BioInd | 04-001-1A | |
| Recombinant mouse M-CSF protein | R&D | Q3U4F9 | |
| Recombinant mouse RANKL protein | R&D | Q3TWY5 | |
| RBC lysis buffer | Beyotime | C3702 | |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | 302643 | |
| Acetone | Shanghai Chemical Co. Ltd. | ||
| Citrate solution | Sigma-Aldrich | 915 | |
| Formaldehyde solution | Shanghai Chemical Co. Ltd. | ||
| Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit | Sigma-Aldrich | 387A-1KT | |
| Fast Garnet GBC Base solution | Sigma-Aldrich | 3872 | |
| Sodium Nitrite Solution | Sigma-Aldrich | 914 | |
| Naphthol AS-BI Phosphate Solution | Sigma-Aldrich | 3871 | |
| Acetate solution | Sigma-Aldrich | 3863 | |
| Tartrate solution | Sigma-Aldrich | 3873 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Corning | 21-031-CVR | |
| L-tartaric acid | Sigma-Aldrich | 251380 | |
| Sodium tartrate dibasic dehydrate | Sigma-Aldrich | s4797 | |
| Glycine | Shanghai Chemical Co. Ltd. | ||
| MgCl2 | Shanghai Chemical Co. Ltd. | ||
| ZnCl2 | Shanghai Chemical Co. Ltd. | ||
| NaOH | Shanghai Chemical Co. Ltd. | ||
| Phosphatase substrate | Sigma-Aldrich | P4744 | |
| anti-Raptor | Cell Signaling Technology | 2280 | |
| anti-P-ribosomal protein S6 (S235/236) | Cell Signaling Technology | 2317 | |
| anti-ribosomal protein S6 | Cell Signaling Technology | 2211 | |
| anti-β-actin | Santa Cruz Biotechnology | sc-130300 | |
| 37% formaldehyde | Xilong scientific | ||
| polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane | Bio-Rad | ||
| Western Chemiluminescent HRP Substrate (ECL) | Millipore | 00000367MSDS | |
| IX71 | Olympus | ||
| Envision | Perkin Elmer | ||
| 0.45-mm Syringe | |||
| Scissor | |||
| Mosquito forcep |
References
- Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).
- Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nature Genetics. 33, 245-254 (2003).
- Feng, X., McDonald, J. M. Disorders of bone remodeling. Annu Rev Pathol. 6, 121-145 (2011).
- Boyce, B. F. Advances in osteoclast biology reveal potential new drug targets and new roles for osteoclasts. J Bone Miner Res. 28 (4), 711-722 (2013).
- Ibbotson, K. J., Roodman, G. D., McManus, L. M., Mundy, G. R. Identification and characterization of osteoclast-like cells and their progenitors in cultures of feline marrow mononuclear cells. J Cell Biol. 99 (2), 471-480 (1984).
- Lacey, D. L., et al. Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation. Cell. 93 (2), 165-176 (1998).
- Wong, B. R., et al. TRANCE is a novel ligand of the tumor necrosis factor receptor family that activates c-Jun N-terminal kinase in T cells. J Biol Chem. 272 (40), 25190-25194 (1997).
- Zoncu, R., Efeyan, A., Sabatini, D. M. mTOR: from growth signal integration to cancer, diabetes and ageing. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (1), 21-35 (2011).
- Bhaskar, P. T., Hay, N. The two TORCs and Akt. Dev Cell. 12 (4), 487-502 (2007).
- Dai, Q., et al. Inactivation of Regulatory-associated Protein of mTOR (Raptor)/Mammalian Target of Rapamycin Complex 1 (mTORC1) Signaling in Osteoclasts Increases Bone Mass by Inhibiting Osteoclast Differentiation in Mice. J Biol Chem. 292 (1), 196-204 (2017).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. . Molecular cloning: a laboratory manual. , (1989).
- Weischenfeldt, J., Porse, B. Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications. CSH Protoc. 2008, (2008).
- Bradley, E. W., Oursler, M. J. Osteoclast culture and resorption assays. Methods Mol Biol. 455, 19-35 (2008).
- Tevlin, R., et al. Osteoclast derivation from mouse bone marrow. J Vis Exp. (93), e52056 (2014).
- Xing, L., Boyce, B. F. RANKL-based osteoclastogenic assays from murine bone marrow cells. Methods Mol Biol. 1130, 307-313 (2014).
- Hsu, H., et al. Tumor necrosis factor receptor family member RANK mediates osteoclast differentiation and activation induced by osteoprotegerin ligand. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (7), 3540-3545 (1999).
- Underwood, J. C. From where comes the osteoclast?. J Pathol. 144 (4), 225-226 (1984).
- Wein, M. N., et al. Control of bone resorption in mice by Schnurri-3. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (21), 8173-8178 (2012).
