Visualizando o macrófago armadilhas extracelular usando microscopia Confocal
Summary
Macrófago extracelulares armadilhas são uma entidade recentemente descrita. Este artigo se concentrará em métodos de microscopia confocal e como eles são visualizadas in vitro e em vivo de amostras do pulmão.
Abstract
Um método primário usado para definir a presença de neutrófilos armadilhas extracelulares (redes) é a microscopia confocal. Modificamos a microscopia confocal estabelecidos métodos para visualizar armadilhas extracellular do macrófago (METs). Estas armadilhas extracelulares são definidas pela presença de cromatina extracelular com expressão co de outros componentes como proteases do grânulo, citrulinado histonas e peptidyl arginase deiminase (PAD). A expressão dos METs geralmente é medida após a exposição a um estímulo e em comparação com amostras não-estimuladas. As amostras também estão incluídas para plano de fundo e do isotipo controle. As células são analisadas usando software de análise de imagem bem definida. Microscopia confocal pode ser usada para definir a presença de metástases tanto in vitro e em vivo no tecido pulmonar.
Introduction
Neutrófilos armadilhas extracelulares (redes), foi primeiramente descrito pelo Brinkmann et al 1 eles são predominantemente produzidos em resposta à infecção (especialmente para as bactérias) e têm um papel importante na defesa de anfitrião1,2. Eles também têm sido descritos para ocorrer em resposta a doenças não-infecciosas, incluindo vasculite e Lúpus eritematoso sistémico (SLE); e ao mitógeno phorbol 12-myrisate 13-acetato (PMA)2,3. Recentemente foi reconhecido que outros tipos de células podem também produzir armadilhas extracelulares, incluindo macrófagos. Armadilhas extracellular do macrófago (METs) ainda não são uma entidade bem definida na literatura4,5. Nós recentemente estabeleceram métodos para detectar a presença de metástases tanto in vitro e in vivode6,7. Neste artigo, será descrita a medição dos METs usando microscopia confocal.
Principais características do NETosis que a distinguem de outras vias celulares (como a apoptose8) são a extrusão da cromatina em conjunto com: (1) citrullination de histonas (H3Cit)9, (2) expressão co de proteases grânulo10 e (3) participação do peptidyl arginina deiminase (PAD) 411,12. Os macrófagos também expressam H3Cit, proteases do grânulo e almofada, e esses recursos podem ser usados para definir a presença de metástases.
Os METs podem ter um papel particularmente importante no pulmão, como o macrófago é a célula dominante presente nos alvéolos e vias aéreas do pulmão e tem papel inicial na direção da resposta imune celular a infecção/inflamação. Além disso, enquanto grande parte do pulmão é espaço vazio (por exemplo, dentro do alvéolo), os METs são potencialmente capazes de expandir-se para o espaço disponível, em contraste com órgãos sólidos.
O método mais utilizado para definir a presença de redes é por microscopia confocal. Não há ainda uma maneira claramente definida para medir METs. A técnica para a medição de redes tem sido adaptada para medir a presença de metástases no presente protocolo. Os requisitos principais para este método são acesso a microscopia confocal e software de imagem apropriado para análise.
Protocol
Representative Results
Discussion
O método descrito nesta revisão é baseado em que usado para definir a presença de redes14. Os macrófagos são, de longe, o tipo de célula dominante em amostras de BAL… e este método de coleta é particularmente adequado para o estudo dos METs. Se células vermelhas do sangue estiverem presentes no BAL, estas células devem ser lysed usando cloreto de amônio. O procedimento de BAL geralmente irá ativar os macrófagos e, portanto, espera-se que haverá METs presentes em amostras não-esti…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado por doações da Monash University, National Health e Medical Research Council e o pulmão de Monash e Instituto do sono. Os autores gostaria de agradecer o pessoal da imunologia clínica na saúde de Monash, Judy Callaghan, Alex Fulcher, Kirstin Elgass e Camden Lo de Monash Micro Imaging (MMI) para obter ajuda com a microscopia confocal da imagem latente, e os autores reconhecem as instalações do MMI da Universidade de Monash. Os autores reconhecem a instalações e assistência científica e técnica da plataforma de histologia de Monash.
Materials
| Human samples: Primary antibodies | |||
| Rabbit anti-human H3Cit (Citrulline R26) | Abcam | AB5103 | 10 ug/ml |
| Rabbit anti-human MMP12 | Novus Biological | NB110-57214 | 1:100 concentration not quantifiable |
| Mouse anti-human MMP9 | Novus Biological | AB119906 | 1:200 ascites, no concentration given |
| Rabbit anti-human PADI2/PAD2 | Abcam | AB16478 | 7 ug/ml |
| Mouse anti-human PADI4/PAD4 | Abcam | AB128086 | 10.1 ug/ml |
| Sheep anti-human NE | LifeSpan Bioscience | LS-B4244 | 25 ug/ml |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse samples: Primary antibodies | |||
| Goat anti-mouse MMP9 | Abcam | AF909 | 10 ug/ml |
| Rabbit anti-mouse H3Cit (Citrulline R26) | Abcam | AB5103 | 10 ug/ml |
| Rat anti-mouse F4/80 | In-house (hybridoma) | In house | 20 ug/ml |
| Sheep anti-human Anti-HNE /NE | Sapphire Bioscience | LS-B4244 | 25 ug/ml |
| Mouse anti-human PADI4/PAD4 | Abcam | AB128086 | 10.1 ug/ml |
| Super-frost plus slides | Menzel | S41104A | |
| Dapi-prolong gold | Molecular probes | P36931 | |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | 85111 | |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | E9434 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Secondary antibodies | |||
| Chicken anti-rabbit AF 488/ | Life technologies | A-21441 | |
| Chicken anti-rabbit AF 594 | Life technologies | A-21442 | |
| Chicken anti-goat AF 594 | Life technologies | a-21468 | |
| Chicken anti-mouse AF488 | Life technologies | A-21200 | |
| Donkey anti-sheep AF 594 | Life technologies | A-11018 | |
| Chicken anti-mouse AF 647 | Life technologies | A-21463 | |
| Donkey anti-sheep AF 594 | Life technologies | A-11016 | |
| Isotype control | |||
| Rabbit IgG | In house | ||
| Rabbit IgG | In house | ||
| Mouse IgG1 | BD Bioscience | 550878 | |
| Rabbit IgG | In house | ||
| Mouse IgG2a | BioLegend | 400201 | |
| Sheep IgG | In house | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software Programs | |||
| Imaris | Bitplane | ||
| Image J | NIH | ||
| To average intensity of fluorphores a standard office application like Microsoft Excel can be used | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopes | |||
| C1 Confocal scanning microscope | Nikon | ||
| FV1200 Confocal scanning microscope | Olympus | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue sources | |||
| Human BAL samples from the bronchoscopy suite at Monash Medical Centre | |||
| Mouse BAL samples and lung tissue from the Department of Pharmacology, University of Melbourne. | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media | |||
| RPMI | Sigma-Aldrich | r8758 | |
| Fetal calf serum | Sigma-Aldrich | F0926 | |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Other reagents | |||
| Sudan black | Sigma-Aldrich | 199664 | |
| paraformaldehyde/periodate/lysine (PLP) fixative | Sigma-Aldrich | 27387 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 214736 | |
| Ketamine | Sigma-Aldrich | K2753 | |
| Natural formalin | Sigma-Aldrich | 42904 | |
| Paraffin | Sigma-Aldrich | 327204 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A2576 | |
| Solvent 3B | Hi-Chem | 2026 | |
| Coverslips 12 ml | Sigma-Aldrich | S1815 | |
| Coverslips 60 x 24 ml | Sigma-Aldrich | C6875 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | |||
| c57 black 6 | Monash animal research platform (MARP) | ||
| BALB/c | MARP |
References
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