Visualiseren van extracellulaire Traps Macrophage met behulp van de Confocal Microscopie
Summary
Macrophage vallen extracellulaire een nieuw beschreven entiteit. Dit artikel zal zich concentreren op confocale microscopie methodes en hoe ze zijn gevisualiseerd in vitro en in vivo van longkanker monsters.
Abstract
Een primaire methode gebruikt om te definiëren van de aanwezigheid van neutrofiele extracellulaire vallen (netten) is confocale microscopie. Wij hebben gevestigde confocale microscopie methodes om te visualiseren macrofaag extracellulaire vallen (METs) bewerkt. Deze extracellulaire traps worden gedefinieerd door de aanwezigheid van extracellulaire chromatine met co uitdrukking van andere onderdelen zoals de submodule proteasen, citrullinated histonen en peptide arginase deiminase (PAD). De expressie van METs is over het algemeen gemeten na blootstelling aan een stimulans en vergeleken met un-gestimuleerd monsters. Monsters zijn ook opgenomen voor achtergrond en isotype controle. Cellen worden geanalyseerd met behulp van welomschreven afbeelding analysesoftware. Confocale microscopie kan worden gebruikt om te definiëren van de aanwezigheid van METs zowel in vitro als in vivo in longweefsel.
Introduction
Neutrofiele extracellulaire vallen (netten), werden voor het eerst beschreven door Brinkmann et al. 1 ze zijn overwegend geproduceerd in reactie op de infectie (vooral voor bacteriën) en hebben een belangrijke rol in host defense1,2. Ze zijn ook beschreven moet worden uitgevoerd in reactie op niet-besmettelijke ziekte, met inbegrip van vasculitis en systemische lupus erythematosus (SLE); en naar de mitogeen phorbol 12-myrisate 13-acetaat (PMA)2,3. Het is onlangs erkend dat andere celtypes extracellulaire vallen, met inbegrip van de macrofagen, ook kunnen produceren. Macrophage extracellulaire vallen (METs) zijn nog niet een goed gedefinieerde entiteit in de literatuur4,5. We hebben onlangs gevestigde methoden voor het detecteren van de aanwezigheid van METs zowel in vitro als in vivo6,7. In dit artikel, zal de meting van METs met behulp van de confocal microscopie worden beschreven.
Zeer belangrijke eigenschappen van NETosis die zich van andere cellulaire routes (zoals apoptosis8 onderscheidt) zijn de extrusie van de chromatine in combinatie met: (1) Citrullinatie van histones (H3Cit)9, (2) mede uiting van de submodule proteasen10 , en (3) betrokkenheid van peptide arginine deiminase (PAD) 411,12. Macrofagen express ook H3Cit, submodule proteasen en PAD en deze functies kunnen worden gebruikt voor het definiëren van de aanwezigheid van METs.
METs hebben soms een bijzonder belangrijke rol in de longen, de macrofaag is de dominante cel aanwezig in de longblaasjes en de luchtwegen van de longen en heeft de eerste rol in de leiding van de cellulaire immuunrespons infectie/ontsteking. Bovendien, terwijl een groot deel van de Long is de lege ruimte (bijvoorbeeldbinnen de longblaasjes), kunnen de METs potentieel uit te breiden in de ruimte beschikbaar is, in tegenstelling tot solide organen.
De meest gebruikte methode om te definiëren van de aanwezigheid van netten is door confocale microscopie. Er is nog niet een duidelijk omschreven manier om te meten METs. De techniek voor de meting van de netten is aangepast voor het meten van de aanwezigheid van METs in dit protocol zijn. De belangrijkste vereisten voor deze methode zijn toegang tot confocale microscopie en passende denkbaar software voor analyse.
Protocol
Representative Results
Discussion
De methode die is beschreven in deze review is gebaseerd op die gebruikt voor het definiëren van de aanwezigheid van netten14. Macrofagen zijn veruit de dominante celtype in BAL monsters en deze methode van collectie is bijzonder geschikt voor de studie van METs. Als de rode bloedcellen in de BAL aanwezig zijn, moeten deze cellen worden lysed met behulp van ammoniumchloride. De BAL procedure zal in het algemeen het activeren van de macrofagen en daarom naar verwachting zullen er METs aanwezig in …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gefinancierd door subsidies van de Monash University, the National Health en Medical Research Council en de Monash Lung en slaap Instituut. De auteurs bedank de medewerkers van klinische immunologie aan Monash gezondheid, Judy Callaghan, Alex Fulcher, Kirstin Elgass en Camden Lo van Monash Micro Imaging (MMI) voor hulp met de confocal microscopie, imaging, en de auteurs erkennen de MMI-faciliteiten van de Monash University. De auteurs erkennen de faciliteiten, en de wetenschappelijke en technische bijstand van de Monash histologie Platform.
Materials
| Human samples: Primary antibodies | |||
| Rabbit anti-human H3Cit (Citrulline R26) | Abcam | AB5103 | 10 ug/ml |
| Rabbit anti-human MMP12 | Novus Biological | NB110-57214 | 1:100 concentration not quantifiable |
| Mouse anti-human MMP9 | Novus Biological | AB119906 | 1:200 ascites, no concentration given |
| Rabbit anti-human PADI2/PAD2 | Abcam | AB16478 | 7 ug/ml |
| Mouse anti-human PADI4/PAD4 | Abcam | AB128086 | 10.1 ug/ml |
| Sheep anti-human NE | LifeSpan Bioscience | LS-B4244 | 25 ug/ml |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse samples: Primary antibodies | |||
| Goat anti-mouse MMP9 | Abcam | AF909 | 10 ug/ml |
| Rabbit anti-mouse H3Cit (Citrulline R26) | Abcam | AB5103 | 10 ug/ml |
| Rat anti-mouse F4/80 | In-house (hybridoma) | In house | 20 ug/ml |
| Sheep anti-human Anti-HNE /NE | Sapphire Bioscience | LS-B4244 | 25 ug/ml |
| Mouse anti-human PADI4/PAD4 | Abcam | AB128086 | 10.1 ug/ml |
| Super-frost plus slides | Menzel | S41104A | |
| Dapi-prolong gold | Molecular probes | P36931 | |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | 85111 | |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | E9434 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Secondary antibodies | |||
| Chicken anti-rabbit AF 488/ | Life technologies | A-21441 | |
| Chicken anti-rabbit AF 594 | Life technologies | A-21442 | |
| Chicken anti-goat AF 594 | Life technologies | a-21468 | |
| Chicken anti-mouse AF488 | Life technologies | A-21200 | |
| Donkey anti-sheep AF 594 | Life technologies | A-11018 | |
| Chicken anti-mouse AF 647 | Life technologies | A-21463 | |
| Donkey anti-sheep AF 594 | Life technologies | A-11016 | |
| Isotype control | |||
| Rabbit IgG | In house | ||
| Rabbit IgG | In house | ||
| Mouse IgG1 | BD Bioscience | 550878 | |
| Rabbit IgG | In house | ||
| Mouse IgG2a | BioLegend | 400201 | |
| Sheep IgG | In house | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software Programs | |||
| Imaris | Bitplane | ||
| Image J | NIH | ||
| To average intensity of fluorphores a standard office application like Microsoft Excel can be used | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopes | |||
| C1 Confocal scanning microscope | Nikon | ||
| FV1200 Confocal scanning microscope | Olympus | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue sources | |||
| Human BAL samples from the bronchoscopy suite at Monash Medical Centre | |||
| Mouse BAL samples and lung tissue from the Department of Pharmacology, University of Melbourne. | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media | |||
| RPMI | Sigma-Aldrich | r8758 | |
| Fetal calf serum | Sigma-Aldrich | F0926 | |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Other reagents | |||
| Sudan black | Sigma-Aldrich | 199664 | |
| paraformaldehyde/periodate/lysine (PLP) fixative | Sigma-Aldrich | 27387 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 214736 | |
| Ketamine | Sigma-Aldrich | K2753 | |
| Natural formalin | Sigma-Aldrich | 42904 | |
| Paraffin | Sigma-Aldrich | 327204 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A2576 | |
| Solvent 3B | Hi-Chem | 2026 | |
| Coverslips 12 ml | Sigma-Aldrich | S1815 | |
| Coverslips 60 x 24 ml | Sigma-Aldrich | C6875 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | |||
| c57 black 6 | Monash animal research platform (MARP) | ||
| BALB/c | MARP |
References
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin?. J Cell Biol. 198 (5), 773-783 (2012).
- Jorch, S. K., Kubes, P. An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease. Nat Med. 23 (3), 279-287 (2017).
- Cheng, O. Z., Palaniyar, N. NET balancing: a problem in inflammatory lung diseases. Frontiers immunol. 4, 1 (2013).
- Boe, D. M., Curtis, B. J., Chen, M. M., Ippolito, J. A., Kovacs, E. J. Extracellular traps and macrophages: new roles for the versatile phagocyte. J Leukoc Biol. 97 (6), 1023-1035 (2015).
- King, P. T., et al. Nontypeable Haemophilus influenzae induces sustained lung oxidative stress and protease expression. PloS one. 10 (3), e0120371 (2015).
- O’Sullivan, K. M., et al. Renal participation of myeloperoxidase in antineutrophil cytoplasmic antibody (ANCA)-associated glomerulonephritis. Kidney Int. 88 (5), 1030-1046 (2015).
- Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).
- Wang, Y., et al. Histone hypercitrullination mediates chromatin decondensation and neutrophil extracellular trap formation. J Cell Biol. 184 (2), 205-213 (2009).
- Papayannopoulos, V., Metzler, K. D., Hakkim, A., Zychlinsky, A. Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps. J Cell Biol. 191 (3), 677-691 (2010).
- Rohrbach, A. S., Slade, D. J., Thompson, P. R., Mowen, K. A. Activation of PAD4 in NET formation. Front Immunol. 3, 360 (2012).
- Lewis, H. D., et al. Inhibition of PAD4 activity is sufficient to disrupt mouse and human NET formation. Nat Chem Biol. 11 (3), 189-191 (2015).
- Ruwanpura, S. M., McLeod, L., Dousha, L. F., et al. Therapeutic Targeting of the IL-6 Trans-Signaling/Mechanistic Target of Rapamycin Complex 1 Axis in Pulmonary Emphysema. Am J Respir Crit Care Med. 194 (12), 1494-1505 (2016).
- Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them. Journal of visualized experiments : JoVE. (36), (2010).
- Chow, O. A., von Kockritz-Blickwede, M., Bright, A. T., et al. Statins enhance formation of phagocyte extracellular traps. Cell host & microbe. 8 (5), 445-454 (2010).
- Wong, K. W., Jacobs, W. R. Mycobacterium tuberculosis exploits human interferon gamma to stimulate macrophage extracellular trap formation and necrosis. J Infect Dis. 208 (1), 109-119 (2013).
