להמחיש מלכודות חוץ-תאי מקרופאג באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית
Summary
מלכודות חוץ-תאי מקרופאג הם ישות שתואר לאחרונה. מאמר זה יתמקד מיקרוסקופיה קונפוקלית שיטות, איך הם דמיינו במבחנה , ויוו מדגימות ריאות.
Abstract
שיטה העיקרי המשמש להגדרת הנוכחות של מלכודות חוץ-תאית נויטרופילים (רשתות) הוא מיקרוסקופיה קונפוקלית. אנחנו ששינית מבוסס מיקרוסקופיה קונפוקלית שיטות כדי להמחיש מלכודות חוץ-תאי מקרופאג (גרורות). אלה מלכודות חוץ-תאית מוגדרים על ידי הנוכחות של כרומטין חוץ-תאית עם ביטוי משותף של רכיבים אחרים כמו גרגר פרוטאזות, שינויים היסטוניים citrullinated peptidyl arginase deiminase (מקלדת). הביטוי של המטס בדרך כלל נמדד לאחר חשיפה לגירוי, לעומת דגימות לא מגורה. דוגמאות כלולים גם על רקע ושליטה isotype. התאים הם ניתחו באמצעות תוכנת ניתוח התמונה מוגדרים היטב. מיקרוסקופיה קונפוקלית עשוי לשמש כדי להגדיר את הנוכחות של המטס גם במבחנה וגם ויוו ברקמת הריאה.
Introduction
מלכודות חוץ-תאית נויטרופילים (רשתות), שתוארו לראשונה על-ידי. Brinkmann et al. 1 הם מיוצרים בעיקר בתגובה לזיהום (במיוחד לחיידקים) ויש להם תפקיד חשוב ב מארח ההגנה1,2. הם גם תוארו להתרחש בתגובה מחלות שאינן זיהומיות, כולל דלקת בכלי הדם, זאבת אדמנתית מערכתית (מירה כהן); ו mitogen phorbol 12-myrisate 13-אצטט (PMA)2,3. זה לאחרונה הוכר כי סוגי תאים אחרים אולי גם לייצר מלכודות חוץ-תאית, כולל מקרופאגים. מלכודות חוץ-תאי מקרופאג (גרורות) עדיין אינם ישות מוגדרים היטב הספרות4,5. לאחרונה הקמנו שיטות כדי לזהות הנוכחות של המטס גם במבחנה וגם ויוו6,7. במאמר זה, המדידה של המטס שימוש מיקרוסקופיה קונפוקלית יתוארו.
תכונות עיקריות של NETosis אשר להבחינו מסלולים סלולר אחרים (כגון אפופטוזיס8) הם ההבלטה של כרומטין בשיתוף עם: (1) citrullination של שינויים היסטוניים (H3Cit)9, (2) ביטוי משותף של פרוטאזות גרגר10 , (3) מעורבות של peptidyl deiminase ארגינין (PAD) 411,12. מקרופאגים אקספרס גם H3Cit, גרגר פרוטאזות, PAD, ניתן להשתמש בתכונות אלה כדי להגדיר את הנוכחות של המטס.
המטס ייתכן תפקיד חשוב במיוחד בריאה, כפי מקרופאג התא דומיננטי נוכח alveoli ואת דרכי הנשימה של הריאות, יש את התפקיד הראשוני של בימוי התגובה החיסונית הסלולר זיהום/דלקת. בנוסף, בעוד הרבה של הריאות הוא חלל ריק (למשל, בתוך alveoli), הגרורות מסוגלים פוטנציאלי להרחיב השטח הזמין, בניגוד לאיברים מוצקים.
השיטה הנפוצה ביותר מגדירים את הנוכחות של רשתות היא על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית. יש עדיין אינה דרך ברורה כדי למדוד את המטס. הטכניקה לשקילת רשתות כבר מותאם כדי למדוד את הנוכחות של המטס ב פרוטוקול זה. הדרישות העיקריות של שיטה זו הם גישה מיקרוסקופיה קונפוקלית ותוכנת הדמיה המתאים לניתוח.
Protocol
Representative Results
Discussion
השיטה המתוארת בסקירה זו מבוססת בשימוש עבור הגדרת הנוכחות של רשתות14. מקרופאגים עד כה סוג התא דומיננטי בדגימות BAL, שיטה זו של אוסף זה מתאים במיוחד ללמוד הגרורות. אם תאי דם אדומים נוכח הכדור, תאים אלה צריך להיות lysed על-ידי שימוש אמוניום כלוריד. ההליך BAL יהיה בדרך כלל להפעיל את המקרו?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו מומן על ידי מענקים אוניברסיטת מונש, הבריאות הלאומיים, המועצה למחקר רפואי, ריאות מונש ואת מכון שינה. המחברים רוצה להודות לצוות אימונולוגיה קלינית בבית הבריאות מונש, ג’ודי קלהאן, אלכס פולקו, השולחן שלי Elgass ו קמדן Lo של מונש מיקרו הדמיה (MMI) לעזרה עם מיקרוסקופיה קונפוקלית הדמיה, ולהכיר המחברים את המתקנים MMI אוניברסיטת מונש. המחברים להכיר את מתקני וסיוע המדעית והטכנית של פלטפורמת היסטולוגיה מונש.
Materials
| Human samples: Primary antibodies | |||
| Rabbit anti-human H3Cit (Citrulline R26) | Abcam | AB5103 | 10 ug/ml |
| Rabbit anti-human MMP12 | Novus Biological | NB110-57214 | 1:100 concentration not quantifiable |
| Mouse anti-human MMP9 | Novus Biological | AB119906 | 1:200 ascites, no concentration given |
| Rabbit anti-human PADI2/PAD2 | Abcam | AB16478 | 7 ug/ml |
| Mouse anti-human PADI4/PAD4 | Abcam | AB128086 | 10.1 ug/ml |
| Sheep anti-human NE | LifeSpan Bioscience | LS-B4244 | 25 ug/ml |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse samples: Primary antibodies | |||
| Goat anti-mouse MMP9 | Abcam | AF909 | 10 ug/ml |
| Rabbit anti-mouse H3Cit (Citrulline R26) | Abcam | AB5103 | 10 ug/ml |
| Rat anti-mouse F4/80 | In-house (hybridoma) | In house | 20 ug/ml |
| Sheep anti-human Anti-HNE /NE | Sapphire Bioscience | LS-B4244 | 25 ug/ml |
| Mouse anti-human PADI4/PAD4 | Abcam | AB128086 | 10.1 ug/ml |
| Super-frost plus slides | Menzel | S41104A | |
| Dapi-prolong gold | Molecular probes | P36931 | |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | 85111 | |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | E9434 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Secondary antibodies | |||
| Chicken anti-rabbit AF 488/ | Life technologies | A-21441 | |
| Chicken anti-rabbit AF 594 | Life technologies | A-21442 | |
| Chicken anti-goat AF 594 | Life technologies | a-21468 | |
| Chicken anti-mouse AF488 | Life technologies | A-21200 | |
| Donkey anti-sheep AF 594 | Life technologies | A-11018 | |
| Chicken anti-mouse AF 647 | Life technologies | A-21463 | |
| Donkey anti-sheep AF 594 | Life technologies | A-11016 | |
| Isotype control | |||
| Rabbit IgG | In house | ||
| Rabbit IgG | In house | ||
| Mouse IgG1 | BD Bioscience | 550878 | |
| Rabbit IgG | In house | ||
| Mouse IgG2a | BioLegend | 400201 | |
| Sheep IgG | In house | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software Programs | |||
| Imaris | Bitplane | ||
| Image J | NIH | ||
| To average intensity of fluorphores a standard office application like Microsoft Excel can be used | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopes | |||
| C1 Confocal scanning microscope | Nikon | ||
| FV1200 Confocal scanning microscope | Olympus | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue sources | |||
| Human BAL samples from the bronchoscopy suite at Monash Medical Centre | |||
| Mouse BAL samples and lung tissue from the Department of Pharmacology, University of Melbourne. | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media | |||
| RPMI | Sigma-Aldrich | r8758 | |
| Fetal calf serum | Sigma-Aldrich | F0926 | |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Other reagents | |||
| Sudan black | Sigma-Aldrich | 199664 | |
| paraformaldehyde/periodate/lysine (PLP) fixative | Sigma-Aldrich | 27387 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 214736 | |
| Ketamine | Sigma-Aldrich | K2753 | |
| Natural formalin | Sigma-Aldrich | 42904 | |
| Paraffin | Sigma-Aldrich | 327204 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A2576 | |
| Solvent 3B | Hi-Chem | 2026 | |
| Coverslips 12 ml | Sigma-Aldrich | S1815 | |
| Coverslips 60 x 24 ml | Sigma-Aldrich | C6875 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | |||
| c57 black 6 | Monash animal research platform (MARP) | ||
| BALB/c | MARP |
References
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin?. J Cell Biol. 198 (5), 773-783 (2012).
- Jorch, S. K., Kubes, P. An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease. Nat Med. 23 (3), 279-287 (2017).
- Cheng, O. Z., Palaniyar, N. NET balancing: a problem in inflammatory lung diseases. Frontiers immunol. 4, 1 (2013).
- Boe, D. M., Curtis, B. J., Chen, M. M., Ippolito, J. A., Kovacs, E. J. Extracellular traps and macrophages: new roles for the versatile phagocyte. J Leukoc Biol. 97 (6), 1023-1035 (2015).
- King, P. T., et al. Nontypeable Haemophilus influenzae induces sustained lung oxidative stress and protease expression. PloS one. 10 (3), e0120371 (2015).
- O’Sullivan, K. M., et al. Renal participation of myeloperoxidase in antineutrophil cytoplasmic antibody (ANCA)-associated glomerulonephritis. Kidney Int. 88 (5), 1030-1046 (2015).
- Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).
- Wang, Y., et al. Histone hypercitrullination mediates chromatin decondensation and neutrophil extracellular trap formation. J Cell Biol. 184 (2), 205-213 (2009).
- Papayannopoulos, V., Metzler, K. D., Hakkim, A., Zychlinsky, A. Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps. J Cell Biol. 191 (3), 677-691 (2010).
- Rohrbach, A. S., Slade, D. J., Thompson, P. R., Mowen, K. A. Activation of PAD4 in NET formation. Front Immunol. 3, 360 (2012).
- Lewis, H. D., et al. Inhibition of PAD4 activity is sufficient to disrupt mouse and human NET formation. Nat Chem Biol. 11 (3), 189-191 (2015).
- Ruwanpura, S. M., McLeod, L., Dousha, L. F., et al. Therapeutic Targeting of the IL-6 Trans-Signaling/Mechanistic Target of Rapamycin Complex 1 Axis in Pulmonary Emphysema. Am J Respir Crit Care Med. 194 (12), 1494-1505 (2016).
- Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them. Journal of visualized experiments : JoVE. (36), (2010).
- Chow, O. A., von Kockritz-Blickwede, M., Bright, A. T., et al. Statins enhance formation of phagocyte extracellular traps. Cell host & microbe. 8 (5), 445-454 (2010).
- Wong, K. W., Jacobs, W. R. Mycobacterium tuberculosis exploits human interferon gamma to stimulate macrophage extracellular trap formation and necrosis. J Infect Dis. 208 (1), 109-119 (2013).
