Этот протокол является восстановление и подготовить редких целевые клетки из смеси с непромысловых фон ячеек для молекулярных генетических характеристик на уровне одной ячейки. ДНК качества равен-лечение единичных клеток и позволяет для одной ячейки приложений (оба скрининг на основе и Целевой анализ).
Редкие целевые клетки могут быть изолированы от высокой фоне непромысловых клеток с использованием антител специфических для поверхностных белков клеток-мишеней. Недавно разработанный метод использует медицинская проволока функционализированных с анти эпителиальных клеток адгезии молекулы (EpCAM) антител в естественных условиях изоляции циркулирующих опухолевых клеток (CTCs)1. Пациента согласованной когорты в не метастатического рака предстательной железы показал, что метод изоляции в естественных условиях привело к более высокий процент больных положительные для CTCs, а также выше пунктам КТК по сравнению с текущей золотой стандарт в перечислении КТК. Как клетки не могут быть восстановлены из текущего медицинских устройств, новых функционализированных проволока (упоминаемый как устройство) был изготовлен позволяет захвата и последующего отряд клеток ферментативной обработки. Клетки могут приложить к устройству, визуализируется на микроскопе и отдельно с помощью ферментативной обработки. Восстановленные клетки cytocentrifuged мембраны покрытием слайды и собирают индивидуально с помощью лазера microdissection или микроманипуляции. Одноклеточных образцы подвергаются затем одноклеточных весь геном амплификации, позволяя несколько ниже по течению анализ, включая скрининг и целевые подходы. Процедура изоляции и восстановления дает высокое качество ДНК из одной клетки и не нанесет ущерба последующим весь геном амплификации (WGA). Одну ячейку амплифицированного ДНК может быть направлен скрининг и/или целевой анализ таких сравнительных генома гибридизации массив (массив CGH) или последовательности. Устройство позволяет ex vivo изоляции от образцы искусственного редких клетки (т.е. 500 клеток-мишеней шипами в 5 мл периферической крови). В то время как показатели отряд клеток являются приемлемыми (50-90%), скорость восстановления клеток отдельные слайды охватывает широкий ассортимент зависит от линии клеток ( 50%) и требует дальнейшего внимания. Это устройство не очищается для использования у пациентов.
Недавно CellCollector DC01, медицинская проволока функционализированных с анти EpCAM антитела для изоляции CTCs из периферической крови больных раком, был добавлен в методических спектр КТК перечисление1,2,3 . В настоящее исследование не метастатического рака простаты функционализированных провод сообщает почти в два раза больше пациентов КТК-позитивными и выше, КТК подсчитывает в КТК позитивных пациентов по сравнению с CellSearch, золотой стандарт в КТК перечисления3 . Благодаря этой обнадеживающие изоляции клеток из функционализированных медицинской проволоки одноклеточного анализа было бы желательным, но Ферментативная обработка растворами отряд ячейки (например , трипсин) ни microdissection лазер позволяет Восстановление нетронутым клеток (данные не показаны).
Чтобы разрешить отряд захваченных клеток, новое поколение функционализированных провода был оборудован конкретных полимеров. Этот полимер, который связывает захвата антител к проводу, восприимчивыми к лечению буфера релиз, позволяя отряд нетронутым клеток (CellCollector DC03 называют устройства). Новых функционализированных устройство позволяет изоляции клеток-мишеней от различных концентраций раковых клеток линии клеток шипами в бычьим сывороточным альбумином (БСА) / фосфат буфер солевой раствор (PBS) и периферической крови, соответственно.
Для облегчения визуального обнаружения клеток на устройстве и после восстановления, целевой раковые клетки обозначены с Карбоксифлуоресцеина succinimidyl эфира (CFSE) и ДНК пятно перед началом восстановления лечения (т.е. Зарядка и отсоединение). Эффекты лечения на ДНК качество одиночных клеток посредством контроля качества ПЦР4,5,6,массив CGH7 ранее оценивались после WGA и целевые последовательности7 показаны никакой разницы по сравнению с micromanipulated-лечение клетки из суспензий клеток7. Преимущество этого метода заключается в сочетание редких целевую ячейку предварительного обогащения и восстановления клеток для одной ячейки вниз по течению анализа (рис. 1). Текущее устройство CE-маркировку в vivo коллекция обычно используется для перечисления ЦОК, а не для одной ячейки молекулярная характеристика2,8. Однако более всесторонний анализ расследовать неоднородность CTCs долго для анализа на уровне отдельной ячейки (т.е. целевые последовательности на уровне одной ячейки). Другие методы, основанные на ячейку основаны на иммуномагнитная изоляции EpCAM позитивных CTCs и обработки одной ячейки, основанные на диэлектрофореза для последующих молекулярно-генетический анализ9,10. Молекулярная характеристика CTCs является важным требованием для их полезной реализация в клинических условиях и столь же важно в фундаментальные исследования метастатического каскада. Параллельно с ЦОК циркулирующей ДНК опухоли (ctDNA) стало большое значение как она позволяет анализ ДНК опухолевых бремени с минимальной технической изоляции процедур11,12. Подходы на основе клеток может служить в качестве дополнительного вклада она позволяет РНК13,14 и белковый анализ выражения15 и также для КТК производных клетки культуры или ксенотрасплантатов16, 17. Несмотря на такие препятствия, как низкая клеток восстановления и разминирования для использования у пациентов по-прежнему необходимо преодолеть, поймать и отпустить метод принимает следующий важный шаг на пути к характеристике редких целевых ячеек.
Описывается протокол направлен на извлечение клеток из функционализированных проволоки (упоминаемый как устройство) для ex vivo одноклеточных геномного анализа. Мы протестировали три EpCAM положительных клеток линии (HT-29, LNCaP и VCaP), но в принципе, этот метод может применяться к любой линии клеток, выражая EpCAM. Целевой EpCAM положительных клеток могут быть представлены на устройство как чисто клеток подвеска (см. 2.1.) или смешанные в избыток фон ячеек (например. периферической крови, смотрите 2.2.). В то время как особенно последний может использоваться для тестирования возможности изоляции в условиях редких клеток, тонкой настройки количество клеток, придает провода может быть сделано с использованием описанных малообъемных подхода (см. 2.3.). Как различия между клеточных линий должны быть предположенным, подходящую ячейку значения плотности для зарядки провода, вращение скорость также, как время инкубации должны быть проверены эмпирически, оценивая количество вложенных клеток с помощью микроскопа иммунофлюоресценции.
Для геномной нисходящие приложения на уровне одной ячейки WGA не требуется. WGA методом выбора могут различаться в разных лабораториях, и, в принципе, наш метод открыты для всех методов, чем может обработать образцы, полученные из микроманипуляции или лазерной microdissection. В этом протоколе мы используем метод, основанный на ферментативно фрагментированных ДНК из-за лучшую производительность по сравнению с тепло фрагментации основе WGA7. Необязательный, одной клетки могут направляться изотермический WGA позволяя последующим ДНК профилирования20,21.
Описывается протокол направлен на восстановление нетронутым клеток после придается новое поколение функционализированных провода для геномного анализа одной ячейки. Первое поколение функционализированных провода, которые также представляют собой устройства CE-утверждены только в естественных условиях обогащения на рынке пока, были использованы для перечисления ЦОК в метастазами раковых больных. Предыдущие публикации и наших собственных данных предложить технику изоляции в естественных условиях , быть более чувствительными по сравнению с текущей технологии золотой стандарт2. Таким образом оснащение этого в естественных условиях изоляции технику с функцией восстановления как понял в устройстве позволяет сочетать высокую КТК восстановления с квалификации на уровне одной ячейки.
Однако устройство не очищается для применения в пациенты, таким образом, клинические данные отсутствуют. Ex vivo приложений (т.е. изоляция CTCs из периферической крови после выборки) не рекомендуется, поскольку технология адаптирована к настройкам в локтевого напрасно, например низкий диаметр напрасно (увеличивая вероятность прямой контакт между CTCs и ловить антител) и время длительного хранения (30 мин., позволяя 2-3 Л крови пройти провод). Однако как об этом говорится в разделе 2.2. клетки-мишени также может быть изолирован от смешанных образцов7.
Текущее ограничение метода является неэффективным восстановление нефиксированных клеток после отсоединения от провода. Это, однако, может улучшить клетки фиксации шаг до лечения отряд.
Таким образом этот протокол является первым шагом к комбинированного использования в естественных условиях изоляции технику с восстановления клеток генетически характеризующих отдельные клетки. Необходимы дальнейшие усилия для решения оптимизации восстановления клеток и оформления для его применения в пациенты1,2. Однако персонализированной медицины для лечения решений мониторинга и терапии выходит перечисление ЦОК. Таким образом этот метод является первым шагом к геномной КТК квалификации на уровне отдельной ячейки.
Приложения к одной ячейки транскриптом анализ кажется возможным, как нетронутыми клетки сжаты. Однако он остается быть оценены ли процедуры восстановления имеет влияние на целостность РНК (например пересылка восстановить отдельные ячейки для прямого лизис следуют RT-ПЦР22). Если успешно, характеристика одиночных клеток (например , ЦОК) можно перемещать на уровень транскриптом, позволяя более подробного анализа. В этой связи, РНК seq использование смарт seq2 обеспечивает ценный инструмент для РНК течению анализа единичных клеток как preamplified cDNA (полученный в ходе подготовки библиотеки РНК seq) могут быть подвергнуты количественного PCR. Это позволит комбинированных целевой и скрининг-анализа единичных клеток восстановленные22,23.
Текущий функционализированных провода основаны на антитела анти EpCAM, который является широко используемым эпителиальных маркера для позитивного выбора CTCs24. Как несколько ЦОК, возможно помощью эпителиальных маркеров, например cytokeratins или EpCAM25, добавив антитела например HER2/новый будет увеличить шанс КТК изоляции. Несколько антител на основе обогащения стратегии были разработаны и рассмотрены Феррейра и др. в 2016 году26. Смесь антител, иммобилизованных на провод может быть будущего совершенствования технологии привело к изоляции более высокий номер и дополнительные подтипы ЦОК.
Он является обязательным для всех шагов, связанных с провода, обработка держать функциональной частью проволоки, погруженной в растворе для того, чтобы сохранить его функциональность. Мы рекомендуем разместить провода в ПБС во время оценки (микроскоп; например. шаги 3.1. -3.3.) и хранения. Для того, чтобы избежать неправильного окрашивания, мы рекомендуем с помощью свежезаваренным подготовлен окрашивание раствора в шагах 1.2.1. и 1.2.2. Слабо окрашенных клеток препятствуют клеток подсчета на проволоку и может привести к недооценке прилагаемый клеток.
Это необходимо, чтобы избежать, подключив пипетку Pasteur с резинового колпачка при вставке провод в пипетку Pasteur для последующей загрузкой суспензию клеток (шаг 2.3.4.). Резиновый колпачок используется для хранения провода на месте, так что функциональная часть находится внутри кончиком пипетки Пастера. Если крышка слишком твердо прилагается к задней части пипетки Пастера, Загрузка суспензию клеток не возможна. В этом случае облегчить крышку таким образом, что воздух, который смещается в суспензию клеток загруженных может оставить пипеткой.
Гибка проволоки имеет решающее значение для ее ориентации во время подсчета шагов 3.2 ячейки. и 3.3. Подключите провода при помощи клейкой ленты, таким образом, что приходит нефункциональные конец провода лечь на одну сторону. После сканирования всей длины функциональной части, провод откатывается 180°, так другая половина функциональных провода могут быть отсканированы. Этот шаг важен для первоначальных экспериментов, чтобы оценить количество клеток на проволоку. После того, как вычисляется количество ячеек для определенной линии клеток и процедуры, процедура может повторяться без подсчета клеток (например. только проверка на наличие клеток или опуская этот шаг). Тщательно закупорить важно избежать потери клеток при уменьшении объема супернатант в шаге 4.8. Убедитесь, что дозирование осуществляется плавно не вызывая турбулентности в гранулы.
The authors have nothing to disclose.
Это исследование финансировалось Австрийский фонд науки (FWF), проект нет. Я 1220-B19 (чтобы Постскриптум) в рамках ERANET проекта в трансляционной рак исследований (TRANSCAN) «Циркуляционной опухолевых клеток как биомаркер для минимальной остаточной болезни рака простаты (КТК-скан)». Аспирант S.C. прошел обучение в рамках Докторской программы молекулярной медицины медицинского университета в Граце. Авторы с благодарностью признаем Нина Schlögl, Даниэль Kummer, Gabi Wendt, Клаудия чудак, Джулия Шульц и Johanna Schiller для их экспертной технической помощи. Авторы благодарят Георг Peinhaupt за поддержку графического дизайна.
Gilupi Release Buffer | Gilupi | GIL083 | Used to detach cells from the wire |
McCoy's 5A Medium (1x) suppl. with L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 16600-082 | Culture medium used for HT-29 cells, adapt culture medium to cell line used for the experiments |
HEPES Buffer Solution (1 M) | PAA | S11-001 | Supplement for McCoy's 5A Medium |
Foetal Bovine Serum Gold | PAA | A15-151 | Supplement for McCoy's 5a Modified Medium |
Penicillin-Streptomycin (100x) | Biowest | L0018-100 | Supplement for McCoy's 5a Modified Medium |
Phosphate Buffered Saline (1x PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010-015 | |
Accutase | Biowest | L0950-100 | Cell detachment solution (cell culture) |
Water bath | GFL | Type 1003 | Used for prewarming solutions |
Incubator | Thermo Fisher Scientific | Used to incubate cells (cell culture) | |
50 mL reaction tubes | VWR | 525-0403 | |
Roller mixer | Stuart Scientific | SRT6D | Used to attach cells to the wire while keeping the cells from sedimenting |
CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Thermo Fisher Scientific | C34554 | Used to label living cells (cytoplasmic label) |
Hoechst 33342 | H3570 | Thermo Fisher Scientific | Used to stain DNA (nucleic counterstain) |
Centrifuge (equipped for holding 15 mL and 50 mL reaction tubes) | Thermo Fisher Scientific | Heraeus Megafuge 40R | Used for pelleting cells |
Observer Z1 (Fluorescence/laser microdissection microscope) | Carl Zeiss Microimaging | Inverted (immunofluorescence) microscope capable of laser microdissection; Fluorescence microscopes must be able to detect Hoechst 33342 (DAPI filter) and CFSE (FITC filter) | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503-50G | Used for coating glass/plastic surfaces |
MS1 Minishaker | Sigma-Aldrich | Z404039 | Used for vortexing |
Vacutainer EDTA (or Na-heparin) tubes | BD | 366450 (or 366480) | Used as reaction tube for ex vivo capture of target cells |
Detektor CANCER03 DC03 | Gilupi | GIL003 | Functionalized wire capable of isolating and detaching EpCAM-positive cells (also referred to as catch&release, C&R) |
Syringe needles (G20) | VWR | 613-0554 | Used to puncture rubber caps in order to allow the non-functional part of the C&R to lead through it |
Neubauer chamber | Roth | T729.1 | Used to count cells |
Pasteur pipettes 150 mm | Volac | D810 | Used for the low-volume application of cells to the C&R |
Grease pen | Dako | S2002 | Used on glass slides to hold cell suspension in place |
Steril syringe filter (0.2 µm) | Corning | 431219 | For filtering freshly prepared Gilupi Release Buffer |
Delfia PlateShaker | Perkin Elmer | 1296-003 | Used for agitation during cell detachment |
1.5 mL tubes | Eppendorf | 30,125,150 | |
Ampli1 WGA Kit | Silicon Biosystems | To be ordered via Silicon Biosystems | |
Axiovert M200 equipped with Mikromanipulator MMJ and CellTram vario | Zeiss/Eppendorf | Use micromanipulation at hand | |
Microcapillaries (25 µm in diameter), CustomTip Type I | Eppendorf | 930001201 | Used for micromanipulating cells |
0.2 mL PCR tubes | Biozym | 710920 | |
Cytocentrifuge and equippment | Hettich | Universal 32 | Use cytocentrifuge at hand |
Thermo cycler | Bio-Rad | DNA Engine Dyad | Every thermo cycler with heated lid can be used |
Microcentrifuge | Roth | CX73.1 | Use desk-top centrifuge at hand |
MembraneSlide 1.0 PET | Zeiss | 415101-4401-050 | Membrane-coated glass slides used for laser microdissection |
UV Stratalinker 1800 | Stratagene | 400072 | Use DNA cross linker at hand |
Standard PCR reagents | |||
6x DNA Loading | Thermo Fisher Scientific | R0611 | Use gel loading dye at hand |
DNA ladder | BioLabs | N0551G | Use 100 bp ladder at hand |
Agarose | Biozym | 840004 | |
Gel electorphoresis station | Bio-Rad | Use electrophoresis system at hand | |
Gel Red Nucleic Acid Stain | Biotium | 41003 | Intercalating dye for DNA visualization In agarose gels |