الخلية الهدف الجينوم قبل التخصيب وكله التضخيم لتوصيف المصب خلية مفردة
Summary
هذا البروتوكول هو لاسترداد وإعداد الخلايا الهدف نادرة من خليط مع الخلايا الخلفية غير المستهدفة لتحديد الخصائص الوراثية الجزيئية على مستوى خلية واحدة. نوعية الحمض النووي يساوي عدم تعامل الخلايا المفردة، ويسمح للتطبيق خلية واحدة (كلا الفرز على أساس وتستهدف تحليل).
Abstract
يمكن أن تكون الخلايا الهدف نادرة معزولة من خلفية عالية من الخلايا غير المستهدفة باستخدام أجسام مضادة محددة للبروتينات السطحية للخلايا الهدف. ويستخدم أسلوب وضعت مؤخرا أسلاك طبية فونكتيوناليزيد مع الخلايا الظهارية المضادة الالتصاق جزيء (ابكام) الأجسام المضادة للعزلة في فيفو تعميم ورم الخلايا (ريادية)1. وأظهرت مجموعة مطابقة المريض بسرطان البروستاتا غير المنتشر أن تقنية العزل في فيفو أدى إلى نسبة أعلى من المرضى إيجابية ريادية، فضلا عن تهم لجنة مكافحة الإرهاب أعلى مقارنة بمعيار الذهب الحالية في التعداد لجنة مكافحة الإرهاب. كما لا يمكن استرداد خلايا من الأجهزة الطبية الحالية، سلك فونكتيوناليزيد جديد (المشار إليها كجهاز) تم تصنيعها من السماح بالتقاط ومفرزة اللاحقة من الخلايا قبل العلاج الأنزيمي. خلايا مسموح بإرفاق الجهاز وتصور في مجهر وفصل استخدام العلاج الأنزيمي. هي سيتوسينتريفوجيد على الشرائح المغلفة بغشاء الخلايا المستردة وتحصد على حدة عن طريق الليزر ميكروديسيكشن أو ميكرومانيبوليشن. ثم تخضع عينات الخلايا المفردة للتضخيم الجينوم كله خلية واحدة مما يتيح تحليل المتلقين للمعلومات متعددة بما في ذلك النهج الفرز ومحددة الهدف. إجراءات العزل والانتعاش غلة عالية الجودة الحمض النووي من الخلايا المفردة، ولا يخل بالتضخيم الجينوم كله اللاحقة (WGA). تضخيم الحمض النووي خلية واحدة يمكن أن تحال إلى الفحص و/أو تستهدف تحليل مثل التهجين الجينوم المقارن صفيف (الصفيف-CGH) أو التسلسل. يسمح هذا الجهاز السابقين فيفو العزلة من عينات خلية نادرة اصطناعية (أي 500 الخلايا المستهدفة التي ارتفعت إلى 5 مل دم المحيطي). بينما معدلات المفرزة من الخلايا مقبولة (50-90 ٪)، يمتد معدل الاسترداد من خلايا منفصلة على شرائح واسعة تعتمد على خط الخلية المستخدمة ( 50 ٪) ويحتاج بعض مزيدا من الاهتمام. لا يتم مسح هذا الجهاز للاستخدام في المرضى.
Introduction
في الآونة الأخيرة، سيلكوليكتور DC01، سلك طبية فونكتيوناليزيد مع الأجسام المضادة-ابكام لعزل ريادية من الدم المحيطي لمرضى السرطان، أضيفت إلى الطيف منهجية لمكافحة الإرهاب التعداد1،2،3 . في دراسة جارية حاليا في سرطان البروستاتا غير المنتشر، هذا السلك فونكتيوناليزيد التقارير تقريبا ضعف عدد المرضى أن لجنة مكافحة الإرهاب-إيجابية وتحسب أعلى لجنة مكافحة الإرهاب في المرضى مصابات بلجنة مكافحة الإرهاب بالمقارنة مع سيلسيرتش، معيار الذهب في لجنة مكافحة الإرهاب التعداد3 . بسبب هذا الأداء المشجع، عزل الخلايا من أسلاك طبية فونكتيوناليزيد لتحليل خلية واحدة سيكون من المستصوب، ولكن لا العلاج الأنزيمي مع الخلية المفرزة الحلول (مثل التربسين) لا ميكروديسيكشن ليزر يسمح استرداد خلايا سليمة (البيانات لا تظهر).
للسماح لمفرزة الخلايا الملتقطة، جيل جديد من الأسلاك فونكتيوناليزيد مجهز بوليمر محددة. هذا البوليمر الذي يربط الأجسام المضادة الالتقاط بالأسلاك، عرضه لمعاملة المخزن مؤقت الإفراج عن السماح لمفرزة من خلايا سليمة (DC03 سيلكوليكتور المشار إليها كجهاز). يسمح هذا الجهاز فونكتيوناليزيد الجديدة، عزل الخلايا الهدف من تركيزات مختلفة من سرطان الخلية خط الخلايا ارتفعت إلى ألبومين المصل البقري (BSA)/الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) والدم المحيطي، على التوالي.
لتسهيل الكشف عن الخلايا المرئية على الجهاز وبعد الانتعاش، هي المسمى الخلايا السرطانية المستهدفة مع إستر سوكسينيميديل “كاربوكسيفلوريسسين” (CFSE) ووصمة الحمض النووي قبل العلاج يتعافى (أي. الشحن وفصل). للعلاج من آثار على نوعية الحمض النووي للخلايا المفردة قيمت سابقا بعد وغ عن طريق مراقبة الجودة بكر4،5،6،CGH الصفيف7 واستهدفت التسلسل7 تبين أي فرق مقارنة ميكرومانيبولاتيد الخلايا غير المعالجة من تعليق خلية7. وميزة هذا الأسلوب يكمن في الجمع بين الخلية الهدف نادرة قبل تخصيب اليورانيوم والانتعاش للخلايا لخلية واحدة تحليل المتلقين للمعلومات (الشكل 1). عموما يتم استخدام جهاز جمع المسمى CE في فيفو الحالي لتعداد ريادية بدلاً من خلية واحدة التوصيف الجزيئي2،8. ومع ذلك، تحليل أكثر شمولاً للتحقيق في عدم التجانس بين ريادية طويلة للتحليل على مستوى الخلية الفردية (أي استهداف التسلسل على مستوى خلية واحدة). الأساليب المستندة إلى خلية أخرى تقوم على عزل إيمونوماجنيتيك ريادية ابكام الإيجابية والتعامل مع خلية واحدة استناداً إلى ديليكتروفوريسيس للتحليل الوراثي الجزيئي اللاحقة9،10. التوصيف الجزيئي ريادية شرط هام لتنفيذها مفيدة في إعداد سريرية، وهو نفس القدر من الأهمية في مجال البحوث الأساسية لتتالي المنتشر. في موازاة ريادية، أصبح يتناقل الورم الحمض النووي (كتدنا) ذات أهمية كبيرة كما أنها تتيح تحليل الحمض النووي من عبء الورم مع الحد الأدنى من العزل التقني إجراءات11،12. الخلية على أساس النهج التي قد تخدم كمساهمة تكميلية كما أنه يسمح للحمض النووي الريبي13،14 والبروتين15 تحليل التعبير وأيضا لمكافحة الإرهاب المستمدة خلية الثقافات أو تكثيفها16، 17-على الرغم من العقبات مثل استرداد خلية منخفض والتخليص للاستعمال في المرضى الذين لا تزال بحاجة للتغلب عليها، يأخذ الأسلوب المصيد والإصدار القادم خطوة هامة نحو تحديد خصائص الخلايا الهدف نادرة.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويهدف البروتوكول وصف استرداد خلايا من سلك فونكتيوناليزيد (المشار إليها كجهاز) السابقين فيفو تحليل الجينوم خلية واحدة. وقمنا باختبار ثلاثة خطوط الخلايا إيجابية ابكام (HT-29 ولنكاب و VCaP)، ولكن من حيث المبدأ، يمكن تطبيق هذا الأسلوب لأي خط الخلية الإعراب عن ابكام. الخلايا الهدف ابكام إيجابية يمكن عرضها على الجهاز كتعليق خلية النقي (انظر 2.1.) أو مختلطة في فائض خلايا الخلفية (مثلاً. المحيطية الدم، راجع 2.2.). حين لا سيما الأخير يمكن أن تستخدم لاختبار قدرات عزلة في ظروف نادرة الخلية، ضبط عدد من الخلايا التي تعلق على السلك يمكن القيام به وصفه صغيرة الحجم باستخدام النهج (انظر 2.3.). نظراً للاختلافات بين خطوط الخلية المتوقعة، سرعة كثافة الخلية المناسبة لشحن السلك، تناوب، فضلا عن وقت الحضانة تحتاج إلى اختبار تجريبي بتقييم العدد الخلايا المرفقة باستخدام مجهر الفلورة.
للجينوم التطبيقات المصب وغ على الصعيد خلية واحدة، هو المطلوب. قد تختلف طريقة وغ الاختيار بين مختبرات، ومن حيث المبدأ، لدينا أسلوب مفتوح لجميع الأساليب مما يمكن معالجة العينات التي تم الحصول عليها من ميكروديسيكشن ميكرومانيبوليشن أو الليزر. في هذا البروتوكول، نحن نستخدم أسلوب يقوم على الحمض النووي انزيماتيكالي مجزأة بسبب أداء أفضل بالمقارنة مع وغ حرارة-تجزئة على أساس7. اختياري، واحدة من الخلايا يمكن أن تحال إلى وغ متحاور السماح للحمض النووي بعد ذلك التنميط20،21.
ويهدف البروتوكول وصف استعادة الخلايا سليمة بعد تولي لجيل جديد من الأسلاك فونكتيوناليزيد لتحليل الجينوم في خلية واحدة. الجيل الأول من الأسلاك فونكتيوناليزيد، التي تمثل أيضا أجهزة التخصيب CE المعتمدة فقط في فيفو في السوق حتى الآن، استخدمت لتعداد ريادية في مرضى السرطان الجسد. المنشورات السابقة والبيانات الخاصة بنا تشير إلى أسلوب العزل في فيفو لتكون أكثر حساسية بالمقارنة إلى معيار الذهب التكنولوجيا الحالية2. وهكذا، تجهيز هذه في فيفو العزلة التقنية مع ميزة استرداد كما أدركت في الجهاز يسمح الجمع بين ارتفاع مكافحة الإرهاب الانتعاش مع توصيف على مستوى خلية واحدة.
ومع ذلك، لا يتم مسح الجهاز للاستخدام في المرضى، وبالتالي، لا تتوفر البيانات السريرية. السابقين فيفو التطبيقات (أي عزل ريادية من الدم المحيطي بعد أخذ العينات) لا ينصح كما أن التكنولوجيا تتكيف مع الإعدادات الحالية في المرفقي عبثا، مثل انخفاض القطر من دون جدوى (زيادة الاحتمال الاتصال بين ريادية والأجسام المضادة لاصطياد المباشر) ووقت الاحتفاظ الطويل (30 دقيقة، مما يتيح ل 2-3 من الدم لتمرير السلك). لكن، وكما هو مبين في القسم 2-2. أيضا يمكن أن تكون الخلايا المستهدفة معزولة من عينات مختلطة7.
حد الحالي للأسلوب هو عدم كفاءة استرداد خلايا غير المثبتة بعد مفرزة من الأسلاك. هذا، ومع ذلك، قد تحسين بخطوة تثبيت خلية قبل العلاج مفرزة.
وخلاصة القول، هذا البروتوكول خطوة أولى نحو الجمع بين استخدام أسلوب العزل في فيفو مع استعادة خلية لتميز وراثيا الخلايا المفردة. بذل المزيد من الجهود بحاجة إلى معالجة الأمثل لاسترداد الخلية والتخليص لتطبيقه في المرضى1،2. ومع ذلك، الطب شخصية لقرارات العلاج للرصد والعلاج يتجاوز تعداد ريادية. وهكذا، هذا الأسلوب خطوة أولى نحو الجينوم توصيف لجنة مكافحة الإرهاب على مستوى الخلية الواحدة.
تطبيقات نحو تحليل الترنسكربيتوم خلية واحدة يبدو ممكناً كما يتم حصاد خلايا سليمة. ومع ذلك، يبقى أن تقيم ما إذا كان الإجراء الذي يتعافى له تأثير على سلامة الحمض النووي الريبي (مثل إعادة توجيه الخلايا المفردة المستردة لتحلل مباشرة متبوعاً RT qPCR22). وإذا نجحت، يمكن أن تحول توصيف الخلايا المفردة (مثل ريادية) إلى مستوى الترنسكربيتوم، مما يتيح إجراء تحليلات أكثر تفصيلاً. وفي هذا الصدد، تسلسل الحمض النووي الريبي استخدام الذكية-seq2 يوفر أداة قيمة لتحليل الحمض النووي الريبي المتلقين للمعلومات من خلايا مفردة كما كدنا بريامبليفيد (التي تم الحصول عليها أثناء إعداد المكتبة تسلسل الحمض النووي الريبي) يمكن أن تخضع ل PCR الكمي. وهذا سيسمح الهدف المشترك والتحليل القائم على فحص خلايا تم استردادها مفردة22،23.
أسلاك فونكتيوناليزيد الحالية تقوم على أجسام المضادة-ابكام الذي علامة الظهارية مستخدمة على نطاق واسع للتحديد الإيجابي ريادية24. كما يمكن ريادية عدة علامات طلائي دوونريجولاتي مثل سيتوكيراتينس أو ابكام25، إضافة الأجسام المضادة مثل HER2/الجديدة ستزيد فرصة لعزل الإرهاب. جسم عدة على أساس تخصيب اليورانيوم قد وضعت استراتيجيات واستعرضها فيريرا وآخرون. في26من عام 2016. يمكن أن تكون خليط من الأجسام المضادة معطلة على سلك تحسين التكنولوجيا مما أدى إلى عزل عدد أكبر وأنواع فرعية إضافية من ريادية في مستقبل.
وملزمة لجميع الخطوات التي تنطوي على سلك التعامل مع إبقاء الجزء الوظيفي من الأسلاك المغمورة في حل من أجل الحفاظ على الوظائف. ونحن نوصي لوضع الأسلاك في برنامج تلفزيوني x 1 خلال التقييم (المجهر؛ على سبيل المثال-خطوات 3.1. -3.3.) والتخزين. تفاديا لتلطيخ غير مناسب، نوصي باستخدام طازجة أعد الحل المصبوغة في خطوات 1.2.1. و 1.2.2. خلايا ضعيفة الملون تعوق خلية العد بالأسلاك وقد يؤدي إلى التقليل الخلايا المرفقة.
من الضروري تجنب يسد ماصة باستور مع غطاء المطاط عند إدخال الأسلاك في ماصة باستور للتحميل اللاحقة من تعليق خلية (الخطوة 2.3.4.). Cap مطاط يستخدم لعقد الأسلاك في مكانها حتى أن يقع الجزء الوظيفي داخل غيض ماصة باستور. إذا تم إرفاق الغطاء أيضا بشدة على الجزء خلفي ماصة باستور، من غير الممكن تحميل تعليق خلية. في هذه الحالة، سهولة عملية النداء الموحد أن الجو الذي شرد من تعليق خلية تحميل يمكن أن تترك الماصة.
الانحناء الأسلاك أمرا حاسما لتوجهها خلال الخلية العد في خطوات 3.2. و 3-3. جبل الأسلاك باستخدام شريط لاصق مثل أن يأتي نهاية السلك غير وظيفية يكذب على جانب واحد. بعد المسح من طول الجزء الوظيفي، يتم إرجاع الأسلاك 180° حتى يمكن مسحها ضوئياً والنصف الآخر من السلك الوظيفي. تعد هذه الخطوة مهمة للتجارب الأولية لتقييم عدد الخلايا بالأسلاك. حالما يتم تقييم عدد الخلايا لخط الخلية وإجراء معين، يمكن أن يتكرر الإجراء دون احتساب الخلية (على سبيل المثال-التحقق من وجود خلايا أو إهمال هذه الخطوة فقط). بيبيتينج دقيق أمر حاسم لتجنب فقدان الخلية عند تقليص حجم المادة طافية في الخطوة 4، 8. تأكد من بيبيتينج تتم بسلاسة دون التسبب في تثربولنسس لبيليه.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذه الدراسة من النمساوية العلم الصندوق (FWF)، المشروع–لا. أنا 1220-B19 (إلى ب. س.) كجزء من مشروع ارنت في المتعدية السرطان البحوث (ترانسكان) “خلايا الأورام يتناقل كالعلامات البيولوجية للأمراض المتبقية ضئيلة في سرطان البروستات (لجنة مكافحة الإرهاب–المسح الضوئي)”. وتم تدريب الدكتوراه المرشح الليبي في إطار برنامج دكتوراه الطب الجزيئي في “جامعة غراتس الطبية”. المؤلفون امتنان تعترف شلوغل نينا، كومر دانيال، Wendt جابي، كوداك كلوديا، شولتز جوليا، وجوانا شيلر لمساعداتها التقنية الخبراء. يشكر المؤلفون غيورغ بينهاوبت لدعم تصميم الرسوم البيانية.
Materials
| Gilupi Release Buffer | Gilupi | GIL083 | Used to detach cells from the wire |
| McCoy's 5A Medium (1x) suppl. with L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 16600-082 | Culture medium used for HT-29 cells, adapt culture medium to cell line used for the experiments |
| HEPES Buffer Solution (1 M) | PAA | S11-001 | Supplement for McCoy's 5A Medium |
| Foetal Bovine Serum Gold | PAA | A15-151 | Supplement for McCoy's 5a Modified Medium |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | Biowest | L0018-100 | Supplement for McCoy's 5a Modified Medium |
| Phosphate Buffered Saline (1x PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010-015 | |
| Accutase | Biowest | L0950-100 | Cell detachment solution (cell culture) |
| Water bath | GFL | Type 1003 | Used for prewarming solutions |
| Incubator | Thermo Fisher Scientific | Used to incubate cells (cell culture) | |
| 50 mL reaction tubes | VWR | 525-0403 | |
| Roller mixer | Stuart Scientific | SRT6D | Used to attach cells to the wire while keeping the cells from sedimenting |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Thermo Fisher Scientific | C34554 | Used to label living cells (cytoplasmic label) |
| Hoechst 33342 | H3570 | Thermo Fisher Scientific | Used to stain DNA (nucleic counterstain) |
| Centrifuge (equipped for holding 15 mL and 50 mL reaction tubes) | Thermo Fisher Scientific | Heraeus Megafuge 40R | Used for pelleting cells |
| Observer Z1 (Fluorescence/laser microdissection microscope) | Carl Zeiss Microimaging | Inverted (immunofluorescence) microscope capable of laser microdissection; Fluorescence microscopes must be able to detect Hoechst 33342 (DAPI filter) and CFSE (FITC filter) | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503-50G | Used for coating glass/plastic surfaces |
| MS1 Minishaker | Sigma-Aldrich | Z404039 | Used for vortexing |
| Vacutainer EDTA (or Na-heparin) tubes | BD | 366450 (or 366480) | Used as reaction tube for ex vivo capture of target cells |
| Detektor CANCER03 DC03 | Gilupi | GIL003 | Functionalized wire capable of isolating and detaching EpCAM-positive cells (also referred to as catch&release, C&R) |
| Syringe needles (G20) | VWR | 613-0554 | Used to puncture rubber caps in order to allow the non-functional part of the C&R to lead through it |
| Neubauer chamber | Roth | T729.1 | Used to count cells |
| Pasteur pipettes 150 mm | Volac | D810 | Used for the low-volume application of cells to the C&R |
| Grease pen | Dako | S2002 | Used on glass slides to hold cell suspension in place |
| Steril syringe filter (0.2 µm) | Corning | 431219 | For filtering freshly prepared Gilupi Release Buffer |
| Delfia PlateShaker | Perkin Elmer | 1296-003 | Used for agitation during cell detachment |
| 1.5 mL tubes | Eppendorf | 30,125,150 | |
| Ampli1 WGA Kit | Silicon Biosystems | To be ordered via Silicon Biosystems | |
| Axiovert M200 equipped with Mikromanipulator MMJ and CellTram vario | Zeiss/Eppendorf | Use micromanipulation at hand | |
| Microcapillaries (25 µm in diameter), CustomTip Type I | Eppendorf | 930001201 | Used for micromanipulating cells |
| 0.2 mL PCR tubes | Biozym | 710920 | |
| Cytocentrifuge and equippment | Hettich | Universal 32 | Use cytocentrifuge at hand |
| Thermo cycler | Bio-Rad | DNA Engine Dyad | Every thermo cycler with heated lid can be used |
| Microcentrifuge | Roth | CX73.1 | Use desk-top centrifuge at hand |
| MembraneSlide 1.0 PET | Zeiss | 415101-4401-050 | Membrane-coated glass slides used for laser microdissection |
| UV Stratalinker 1800 | Stratagene | 400072 | Use DNA cross linker at hand |
| Standard PCR reagents | |||
| 6x DNA Loading | Thermo Fisher Scientific | R0611 | Use gel loading dye at hand |
| DNA ladder | BioLabs | N0551G | Use 100 bp ladder at hand |
| Agarose | Biozym | 840004 | |
| Gel electorphoresis station | Bio-Rad | Use electrophoresis system at hand | |
| Gel Red Nucleic Acid Stain | Biotium | 41003 | Intercalating dye for DNA visualization In agarose gels |
References
- Saucedo-Zeni, N., et al. A novel method for the in vivo isolation of circulating tumor cells from peripheral blood of cancer patients using a functionalized and structured medical wire. Int J Oncol. 41 (4), 1241-1250 (2012).
- Gorges, T. M., et al. Enumeration and Molecular Characterization of Tumor Cells in Lung Cancer Patients Using a Novel In Vivo Device for Capturing Circulating Tumor Cells. Clin Cancer Res. 22 (9), 2197-2206 (2016).
- Kuske, A., et al. Improved detection of circulating tumor cells in non-metastatic high-risk prostate cancer patients. Sci Rep-UK. 6 (1), (2016).
- van Beers, E. H., et al. A multiplex PCR predictor for aCGH success of FFPE samples. Brit J Cancer. 94 (2), 333-337 (2006).
- El-Heliebi, A., Chen, S., Kroneis, T. Using Multiplex PCR for Assessing the Quality of Whole Genome Amplified DNA. Methods Mol Biol. 1347, 119-128 (2015).
- Möhlendick, B., et al. A Robust Method to Analyze Copy Number Alterations of Less than 100 kb in Single Cells Using Oligonucleotide Array CGH. PLoS ONE. 8 (6), e67031 (2013).
- Chen, S., et al. Catch and Release: rare cell analysis from a functionalised medical wire. Sci Rep-UK. 7, 43424 (2017).
- Zhang, H., et al. Enumeration and molecular characterization of circulating tumor cell using an in vivo capture system in squamous cell carcinoma of head and neck. Chin J Cancer Res. 29 (3), 196-203 (2017).
- Carter, L., et al. Molecular analysis of circulating tumor cells identifies distinct copy-number profiles in patients with chemosensitive and chemorefractory small-cell lung cancer. Nat Med. 23 (1), 114-119 (2017).
- Luca, F. D., et al. Mutational analysis of single circulating tumor cells by next generation sequencing in metastatic breast cancer. Oncotarget. , (2016).
- Aravanis, A. M., Lee, M., Klausner, R. D. Next-Generation Sequencing of Circulating Tumor DNA for Early Cancer Detection. Cell. 168 (4), 571-574 (2017).
- Page, K., et al. Next Generation Sequencing of Circulating Cell-Free DNA for Evaluating Mutations and Gene Amplification in Metastatic Breast Cancer. Clin Chem. 63 (2), 532-541 (2017).
- Kalinich, M., et al. An RNA-based signature enables high specificity detection of circulating tumor cells in hepatocellular carcinoma. P Natl Acad Sci USA. 114 (5), 1123-1128 (2017).
- Gorges, T. M., et al. Accession of Tumor Heterogeneity by Multiplex Transcriptome Profiling of Single Circulating Tumor Cells. Clin Chem. 62 (11), 1504-1515 (2016).
- Sinkala, E., et al. Profiling protein expression in circulating tumour cells using microfluidic western blotting. Nat Commun. 8, 14622 (2017).
- Morrow, C. J., et al. Tumourigenic non-small-cell lung cancer mesenchymal circulating tumour cells: a clinical case study. Ann Oncol. 27 (6), 1155-1160 (2016).
- Williamson, S. C., et al. Vasculogenic mimicry in small cell lung cancer. Nat Commun. 7, 13322 (2016).
- Czyż, Z. T., Stoecklein, N. H., Polzer, B. Laser Microdissection of FFPE Tissue Areas and Subsequent Whole Genome Amplification by Ampli1TM. Methods Mol Biol. 1347, 141-162 (2015).
- Czyż, Z. T., Klein, C. A. Deterministic Whole-Genome Amplification of Single Cells. Methods Mol Biol. 1347, 69-86 (2015).
- Kroneis, T., et al. Automatic retrieval of single microchimeric cells and verification of identity by on-chip multiplex PCR. J Cell Mol Med. 14 (4), 954-969 (2010).
- Kroneis, T., et al. Combined Molecular Genetic and Cytogenetic Analysis from Single Cells after Isothermal Whole-Genome Amplification. Clin Chem. 57 (7), 1032-1041 (2011).
- Kroneis, T., Jonasson, E., Andersson, D., Dolatabadi, S., Ståhlberg, A. Global preamplification simplifies targeted mRNA quantification. Sci Rep-UK. 7, 45219 (2017).
- Picelli, S., Faridani, O. R., Bjorklund, A. K., Winberg, G., Sagasser, S., Sandberg, R. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nat Protoc. 9 (1), 171-181 (2014).
- El-Heliebi, A., Heitzer, E., Kroneis, T., Chen, S., Haudum, C., Fuchs, J. Potential and Challenges of Liquid Biopsies. Mechanisms of Molecular Carcinogenesis. 2, 233-261 (2017).
- Lamouille, S., Xu, J., Derynck, R. Molecular mechanisms of epithelial-mesenchymal transition. Nat Rev Mol Cell Bio. 15 (3), 178-196 (2014).
- Ferreira, M. M., Ramani, V. C., Jeffrey, S. S. Circulating tumor cell technologies. Mol Oncol. 10 (3), 374-394 (2016).
