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Cancer Research

Destino celular genoma pre-enriquecimiento y toda amplificación sola célula caracterización aguas abajo

Published: May 15, 2018
doi:
10.3791/56394
, , , , , , , ,
1Institute of Cell Biology, Histology and Embryology,Medical University of Graz, 2Institute of Pathology,Medical University of Graz, 3Fraunhofer Institute for Toxicology and Experimental Medicine ITEM, 4Department of Tumor Biology,University Medical Center Hamburg-Eppendorf, 5Sahlgrenska Cancer Center,University of Gothenburg

Summary

Este protocolo es recuperar y preparar dianocitos rara de una mezcla con las células de distintos antecedentes caracterización genética molecular a nivel unicelular. Calidad de ADN es igual a las células no tratadas y permite aplicación unicelular (ambos proyección base y objetivo análisis).

Abstract

Células blanco raro pueden ser aisladas de un alto fondo de células no objetivo utilizando anticuerpos específicos para proteínas de la superficie de las células diana. Un método recientemente desarrollado utiliza un alambre médico funcionalizado con anticuerpos de molécula (EpCAM) de adherencia de célula epitelial contra en vivo aislamiento de circulación tumor células (CTC)1. Una cohorte emparejado de paciente en cáncer de próstata no metastásico demostró que la técnica de aislamiento en vivo resultó en un mayor porcentaje de pacientes positivos para CTC, así como mayor CTC cuentas en comparación con el patrón oro en enumeración de CTC. Como las células no pueden ser recuperadas de los dispositivos médicos actuales, fue fabricado un nuevo cable funcionalizado (denominado dispositivo) lo que permite la captura y posterior desprendimiento de las células por tratamiento enzimático. Las células están autorizadas a conectar al dispositivo, visualizados en el microscopio y separada mediante tratamiento enzimático. Las células recuperadas son cytocentrifuged en portaobjetos recubiertos con membrana y cosechan individualmente mediante Microdisección láser o micromanipulación. Sola célula muestras son entonces sometidas a amplificación sola célula genoma permitiendo múltiples análisis aguas abajo como métodos de screening y específico del destino. El procedimiento de aislamiento y recuperación produce alta calidad de ADN de las células y no impide la amplificación del genoma entero posterior (WGA). ADN amplificado de una sola célula puede enviarse a proyección o dirigida análisis de hibridación genómica comparativa de matriz (array-CGH) como secuencia. El dispositivo permite ex vivo aislado de muestras de células raras artificial (es decir 500 células blanco tacon en 5 mL de sangre periférica). Mientras que las tasas de desprendimiento de las células son aceptable (50-90%), la tasa de recuperación de células separadas en diapositivas abarca una amplia gama depende de la línea celular utilizada ( 50%) y necesita más atención. Este dispositivo no se despejó para el uso en pacientes.

Introduction

Recientemente, CellCollector DC01, un alambre médico funcionalizado con anticuerpos anti-EpCAM para aislar CTCs de sangre periférica de pacientes con cáncer, fue agregado a la gama metódica de CTC enumeración1,2,3 . En un estudio actualmente en curso en cáncer de próstata no metastásico, este cable funcionalizado divulga a casi dos veces tantos pacientes CTC-positivas y mayor CTC cuenta en CTC-pacientes positivos en comparación con CellSearch, el estándar de oro para enumeración CTC3 . Debido a este alentador desempeño, aislamiento de las células de un alambre médico funcionalizado para el análisis unicelular sería deseable, pero tratamiento enzimático con soluciones de separación celular (por ejemplo, tripsina) ni Microdisección láser permite la recuperación de las células intactas (datos no mostrados).

Para permitir la separación de las células capturadas, una nueva generación de cables funcionalizados fue equipada de un polímero específico. Este polímero, que une a los anticuerpos de captura con el alambre, es susceptible a un tratamiento de buffer de liberación que permite la separación de las células intactas (CellCollector DC03 denominado dispositivo). El nuevo dispositivo funcionalizado, permite el aislamiento de las células de la blanco de varias concentraciones de células de cáncer de la célula línea muestras mezcladas, albúmina de suero bovino (BSA) / fosfato tampón salino (PBS) y sangre periférica, respectivamente.

Para facilitar la detección visual de las células en el dispositivo y después de la recuperación, las células de cáncer blanco son etiquetadas con éster de succinimidyl carboxyfluorescein (CFSE) y una mancha de ADN antes del tratamiento de recuperación (es decir. carga y desmontaje). Los efectos del tratamiento sobre la calidad del ADN de las células previamente fueron evaluados después de WGA por medio de un control de calidad PCR4,5, array-CGH6,7 y dirigido la secuencia7 no mostrando ninguna diferencia comparados con no tratados las células micromanipulated de suspensiones de células7. La ventaja de este método radica en la combinación de enriquecimiento previo rara de célula diana y la recuperación de las células unicelulares análisis aguas abajo (figura 1). El actual dispositivo de recolección con etiqueta CE en vivo es generalmente usado para recuento de CTC en lugar de caracterización molecular de la célula de solo2,8. Sin embargo, análisis más exhaustivo para investigar la heterogeneidad entre los CTCs para análisis a nivel de células individuales (es decir, dirigida la secuencia en el nivel unicelular). Otros métodos basados en la célula se basan en el aislamiento Inmunomagnética de CTC EpCAM positivos y manejo sola célula basado en dielectroforesis para posterior análisis genético molecular9,10. Caracterización molecular de CTC es un requisito importante para su aplicación útil en un ajuste clínico y es igualmente importante en la investigación básica de la cascada metastásica. En paralelo a la CTC, ADN tumoral circulante (ctDNA) se ha convertido en de gran importancia ya que permite el análisis de la DNA de la carga del tumor con mínimo aislamiento técnico procedimientos11,12. Los enfoques de base de la célula podrían servir como un aporte complementario que permite RNA13,14 y proteína15 análisis de la expresión y también para CTC derivan célula culturas o xenoinjertos16, 17. aunque todavía necesitan superar obstáculos tales como recuperación de la célula bajo y espacio para el uso en pacientes, el método de captura y liberación toma un importante paso hacia la caracterización de las células blanco raro.

Protocol

Todos los procedimientos han sido aprobados por el Comité de ética de la Universidad médica de Graz (25-240 ex 12/13). Sangre periférica para clavar los experimentos se tomaron muestras de individuos sanos. Nota: Este protocolo describe el aislamiento de las células HT-29 (línea de celular del cáncer del colon humano) de PBS o de mezclas artificiales de células HT-29 y sangre periférica. El mismo experimento fue realizado con dos líneas celulares adicionales (LNCaP y VCaP, datos experimentales en los resultados de representante) y teóricamente se puede realizar con todas las células expresan EpCAM. 1. preparación de las células diana Cultivo celular y el etiquetado de célulasNota: En el presente Protocolo, las células se cultivan en frascos de cultivo 75 cm². Favor de ajustar las cantidades de reactivos en consecuencia si se utilizan otros dispositivos de la cultura de célula (e.g. cm² 25 platos de cultivo, placas de 6 pocillos, etcetera). Todos los líquidos utilizados son previamente calentados a 37 ° C en un baño de agua. Si no se indica lo contrario, todos los pasos de protocolo se realizan a temperatura ambiente (RT). Células HT-29 cultura 5a modificado suplementado de McCoy con 2 mM L-glutamina, 20 mM Hepes, 10% suero bovino fetal (FBS) y 1% de penicilina/estreptomicina a 37 ° C en una atmósfera de 5% CO2 . Cuando las células son 90% confluente, quitarlo del medio y lavar las células con 10 mL de PBS 1 x. Para cosechar las células, agregar 2 mL de la solución de la separación de células (tabla de materiales y reactivos) a las células e incubar las células durante aproximadamente 5 minutos a 37 ° C.Nota: La solución de separación contiene proteolíticas y colagenolíticas enzimas de 1 x PBS, 0,5 mM ácido de etilendiaminotetracético (EDTA) y rojo de fenol de 3 mg/L. Reducir el tiempo de precalentamiento de la solución de la separación de células a un mínimo como este será inactivo después de 1 h a 37 ° C. Cubrir la capa de célula entera para obtener la separación óptima de la célula. Compruebe la separación de las células utilizando un microscopio invertido. Transferir todo independiente de las células a un tubo de 50 mL Prellenado con 10 mL de medio de cultivo celular (el mismo que utilizan en el paso 1.1.1.) y resuspender las células mediante pipeteo. Coloque la suspensión restante de células en un mezclador de rodillos horizontales a temperatura ambiente y proceder al etiquetado paso. Etiquetado celular de las células Diana en vivo Diluir 1 μl de 5 mM CFSE (suministrado en dimetil sulfóxido, DMSO) en 1 mL de PBS 1 x pre-calentado a 37 ° C para obtener la solución de etiquetado 5 μm listo para su uso CFSE.Nota: Para óptimos resultados de tinción, utilizar soluciones recién preparadas. Preparar una lista para usar ADN tinción solución (tabla de materiales y reactivos) en PBS 1 x y almacenar a 2-6 ° C, protegido de la luz.Nota: Para óptimos resultados de tinción, utilizar soluciones recién preparadas. Obtener las células de mezclador de rodillos horizontales (paso 1.1.6.) y pellets de que las células a 300 x g durante 10 minutos retirar el sobrenadante y resuspender las células en 10 mL de PBS 1 x. Enjuague las células otra vez con PBS 1 x y resuspender el precipitado de células en solución etiquetado de 500 μl listo para su uso CFSE. Incubar las células a 37 ° C durante 15 min y recoger las células después de la centrifugación a 300 x g durante 3 minutos. Resuspender las células con 1 mL de medio de cultivo celular precalentado y permitir a las células regenerar a 37 ° C durante 30 minutos. La cosecha de las células por centrifugación a 300 x g durante 3 min y resuspender el pellet celular en 1 mL de ADN listo para usar tinción solución a 37 ° C durante 10 minutos. Sedimenten las células, eliminar el sobrenadante y resuspender las células en 4 mL de PBS 1 x. Evaluar la densidad de células usando un hemocitómetro y comprobar la fluorescencia etiquetado utilizando un microscopio de fluorescencia había equipado con 4′ 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) e isotiocianato de fluoresceína filtros (FITC) (figura 2A y 2E). Centrifugar las células a 300 x g durante 3 min y resuspender el precipitado de células según las densidades de célula necesaria para el experimento respectivo tal como se indica en la siguiente sección y el lugar en el hielo. 2. el cable de carga Nota: Las células pueden ser aisladas de destino celular periférico sangre spikings en la escala de mililitro o proporcionando cantidad baja de células en una escala de microlitro. Considerando que el abordaje anterior permite para mímico condiciones raras células en sangre periférica, esta última puede ser la forma preferida de conectar algunas células con el fin de optimización y prueba de protocolo. Carga el cable usando una gran cantidad de suspensiones celulares Preparar una BSA 2% solución de bloqueo por disolver 0,8 g de BSA en 40 mL de PBS 1 x (uso de la cultura de célula). Disolver BSA por Vortex inicial y posterior incubación a temperatura ambiente en un mezclador horizontal del rodillo para 10-20 minutos. Enjuague vacío EDTA sodio tubos tubos de heparina con 2 mL de BSA 2% para eliminar los residuos de anticoagulante y deseche la solución. Bloque de la superficie del tubo por la incubación a temperatura ambiente con 5 mL de BSA 2% en un mezclador del rodillo horizontal a 15 rpm por 30 min y deseche la solución. Diluir con células (sección 1.2.) a una densidad de 100 000 células/ml y 5 mL para el cable de carga. Añadir 5 mL de la suspensión con la célula (células de 500 000 en total) al tubo. Evitar las burbujas cuando se añade la suspensión de células. Quite el cable del compartimiento de almacenamiento, así como la tapa de goma que sostiene el alambre y enjuague de PBS 1 x (figura 3). Penetrar la tapa de tubo de goma del tubo de EDTA (paso 2.1.4.) con la ayuda de una aguja de jeringa (20G) e inserte el cable tal que la parte funcional se sumerge totalmente en la suspensión de células cuando la tapa en el tubo y el tubo se coloca en la mezcladora de rodillos inclinada.Nota: La parte funcional triple helicoidal del alambre debe cubrirse con la suspensión de células a lo largo de la carga. Gire los tubos en un mezclador de rodillos inclinada a 5 rpm por 30 min permitir que las células se conecte al cable. Enjuague el alambre con 5 mL 1 x PBS y almacenar en la oscuridad a 2-6 ° C en un tubo de 15 mL que contiene 1 x PBS hasta el examen visual.Nota: La parte funcional del alambre debe estar siempre sumergida en PBS para evitar dañar las células. Aislar a las células diana de mezclas artificiales con sangre periférica (método de carga alternativo: 2.1. Carga el cable usando una gran cantidad de suspensiones celulares) Diluir con células (sección 1.2.) para obtener suspensiones celulares con alta densidad celular (> 1 000 000 células/mL), de tal modo mantener bajo el volumen de la suspensión celular a la sangre periférica. Agregar 500 a 500 000 células en 5 mL de sangre periférica y mezclar por inversión del tubo. Quite el cable del compartimiento de almacenaje, quite la tapa de goma que sostiene el alambre y enjuague en PBS 1 x. Penetrar un nuevo casquillo de tubo con la parte no funcional del dispositivo usando una aguja de jeringa (20G) tal que la parte funcional se sumerge totalmente en la sangre con picos cuando la tapa en el tubo y el tubo se coloca en la mezcladora de rodillos inclinada.Nota: La parte funcional triple helicoidal del alambre debe cubrirse con la suspensión de células a lo largo de la carga. Incubar el tubo en el mezclador de rodillos inclinada a 5 rpm por 30 min a TA. Enjuague el alambre 3 veces en PBS 1 x y almacenar en la oscuridad en un tubo de 15 mL que contiene 1 x PBS hasta el examen visual.Nota: La parte funcional del cable siempre debe estar sumergida para evitar dañar las células. El alambre de suspensiones celulares de bajo volumen de carga (método de carga alternativo: 2.1. Carga el cable usando una gran cantidad de suspensiones celulares) Resuspender las células con 1 000 000 células/ml de 1 x PBS. Fijar un vaso desechable pipeta Pasteur de 150 mm horizontalmente en un rack. Saque el cable del compartimiento de almacenamiento pero mantener la tapa de goma amarillo que sostiene el alambre. Coloque el cable en la pipeta de tal manera que la parte funcionalizada está situada en la punta de la pipeta de Pasteur no tocar el vidrio.Nota: La punta del cable no debe quedar fuera de la punta de la pipeta de Pasteur. Evite enchufar el extremo posterior de la punta de la pipeta de Pasteur con la tapa de goma que sostiene el alambre. Si bien, suspensiones celulares no se puede cargar desde el otro lado en la punta. 15 μl de la suspensión de células de carga en la punta de la pipeta de Pasteur que cubre la parte funcionalizada del alambre. Incubar el alambre durante 10 minutos manualmente cuarto de vuelta la punta montado wire/Pasteur cada minuto. Quite el cable de la punta de la pipeta de Pasteur, enjuague en 5 mL de PBS 1 x y guardar en la oscuridad a 2-6 ° C en un tubo de 15 mL que contiene 1 x PBS hasta el examen visual.Nota: La parte funcional siempre debe estar sumergida en 1 x PBS para evitar dañar las células. 3. recuento de células en el alambre Nota: Mantenga siempre la parte funcional del alambre sumergido en 1 x PBS para evitar dañar las células. Utilice un lápiz de grasa para dibujar un área de rectángulo sobre un portaobjetos de vidrio y agregar 500 μl de PBS 1 x. Doble la parte no funcional del alambre y colóquela sobre el portaobjetos de cristal tal que la parte funcional se encuentra inmerso en PBS 1 x.Nota: Ajuste el área del rectángulo y el volumen de 1 x PBS para cubrir completamente la parte funcional del alambre. Utilice una cinta adhesiva de doble cara para montar la parte no funcional del alambre de la diapositiva. Inspeccione ambos lados del cable para enumerar las células capturadas (figura 2B y 2F).Nota: Se determinó la presencia de las células utilizando un microscopio de fluorescencia equipado con filtros DAPI y FITC. Ambos lados del cable pueden ser inspeccionados y el número de células o evaluado (para un número alto de células) o contado (sólo factible si los números bajos de células están Unidos al cable). Este paso puede omitirse si la enumeración de células no es necesario. Después del análisis, coloque el cable en el tubo de 15 mL que contiene PBS 1 x (véase la nota de 2.3.6. y sección 3.), guardar el alambre en oscuridad.Nota: La mayoría de la parte no funcional del cable se puede cortar (incluyendo el codo) y quita almacenamiento aliviando. 4. la separación y recuperación de las células diana Nota: La separación de las células se realizará dentro de 4 h después de aislamiento. Disolver 4 mg del componente de búfer de lanzamiento (tabla de materiales y reactivos) por mL de 1 x PBS y filtrar la solución a través de un filtro estéril de 0,2 μm para obtener el buffer listo para su uso.Nota: El polímero del alambre se compone de un hidrogel que es funcionalizado con anticuerpos anti-EpCAM permitiendo la Unión a las células Diana que presenta EpCAM. El búfer de liberación contiene una enzima proteolítica del oxígeno de carbono capaz de unirse el hidrogel. Clivaje proteolítico resulta en la degradación del polímero y, por tanto, la separación de las células capturadas. Precalentar el buffer de liberación a 37 ° C durante 5 minutos. Añadir 1,6 mL de tampón de liberación para llenar un tubo de reacción de 1,5 mL.Nota: Diseñados para volúmenes de reacción de 1.5 mL los tubos permiten aplicación de 1.6 mL que es necesario sumergir la parte funcional del alambre. Incubar la parte funcional del alambre en el búfer de liberación a 37 ° C (baño de agua) 20 minutos usar el tapón de goma con el alambre en vez de la tapa del tubo para fijar el alambre en el tubo de 1,5 mL para evitar la contaminación durante la incubación en el baño de agua. Transferir el conjunto del alambre/tubo a una coctelera en RT y 500 rpm por 15 min.Nota: La coctelera tiene una órbita de 1, 5 mm. Coloque el conjunto del alambre/tubo en una centrífuga y centrifugar a 300 x g durante 10 minutos. Quite el cable del tubo, cierre la tapa y centrifugar el tubo a 300 x g durante 10 min.Nota: El cable puede almacenarse en PBS 1 x a 2-6 ° C en la oscuridad para el recuento de células evaluar la separación eficiencia/check para las celdas restantes en el alambre. Para reducir el volumen de la suspensión de células, eliminar todos pero 100 μl (micromanipulación) o alternativamente 300 μL (citocentrifugación y Microdisección láser posterior) del sobrenadante y proceder inmediatamente a muestreo unicelular. 5. sola celda muestreo MicromanipulaciónNota: Las células se añadirá a 2 μl de mezcla de maestro del lisis celular permitiendo WGA. Preparar mezcla principal según el número de celdas a procesar, calcular volúmenes extras de pérdida debido a pipetear y lugar celular lisis master mix en el hielo. Preparar la mezcla principal (componentes de kit de WGA, tabla de materiales y reactivos) de célula lisis según el protocolo descrito por Czyż et al18. Mezclar brevemente, 2.0 μL de buffer de reacción, de 1,3 μl de octylphenoxypolyethoxyethanol (solución al 10%), 1,3 μl de 4-(1,1,3,3-tetramethylbutyl) fenil-polietilenglicol (solución al 10%), 2,6 μl de una solución de proteinasa K y 12,8 μl libre de DNasa/Rnasa agua para obtener una mix Master para 10 muestras (volumen total 20 μl).Nota: Para las muestras más, aumentar los volúmenes en consecuencia. La composición de la mezcla principal de lisis celular difiere del utilizado en el procedimiento alternativo utilizando muestras de Microdisección láser (véase 5.2.). Utilice un lápiz de grasa para dibujar un área que se mantiene la suspensión de células en su lugar. Ajustar el área y el volumen si la densidad celular es demasiado alta (es decir. marcar un área más grande en el portaobjetos de cristal, 1 x PBS y una alícuota de la suspensión de células de carga). Pipetear la suspensión de toda la célula teñida (obtenida en el paso 4.8.) sobre el portaobjetos de cristal. Transferir el portaobjetos de cristal en un microscopio equipado con un micromanipulador. Que las células reposar 5 minutos (Figura 2D y 2 H). Preparar 0,2 mL PCR tubos cargados con 2.0 μL de la master de lisis celular mezclan (vea el paso 5.1.1.) y almacenan en hielo. Recoger las células de 1 μl de PBS 1 x con el micromanipulador y transferir las células a un tubo que contiene la mezcla principal de lisis celular.Nota: Para transferir las células micromanipulated en el búfer de lisis celular Coloque el tubo capilar directamente en 2 μl de solución de lisis y expulsar hasta que las burbujas pueden verse. Girar brevemente por la muestra a 2000 x g durante 3 s con una microcentrífuga de sobremesa para recoger todo el líquido en la parte inferior del tubo. Coloque las muestras en hielo. Proceder directamente a WGA unicelular (ver sección 6. Czyż et al. 19). Microdisección por láser (método de muestreo alternativo de unicelular: 5.1. Micromanipulación)Nota: La composición de la mezcla principal utilizada en esta sección difiere del utilizado en la sección 5.1 para micromanipulación. Las células se añadirá a 4.5 μl de mezcla principal lisis de la célula (componentes de kit de WGA, tabla de materiales y reactivos) por WGA. Preparar la mezcla principal de la lisis celular según Czyż et al. 19 por mezclar 5,0 μL de tampón de reacción, de 1,3 μl de octylphenoxypolyethoxyethanol (solución al 10%), 1,3 μl de 4-(1,1,3,3-tetramethylbutyl) fenil-polietilenglicol (solución al 10%), resp., 2,6 μl de una solución de proteinasa K y 34,8 μl de Rnasa / Agua libre de DNAsas para obtener una mezcla maestra para 10 muestras (μL volumen total 45). Coloque la mezcla principal en hielo.Nota: Para las muestras más, aumentar los volúmenes en consecuencia. Portaobjetos recubiertos con membrana tratamiento UV apto para Microdisección láser. Por lo tanto, coloque los portaobjetos en un ADN Cruz dispositivo vinculador y exponer a los rayos UV más alto durante unos 10 minutos. Montar el portaobjetos recubiertos de membrana en una Citocentrifuga cytospin la suspensión de toda la célula a 300 x g durante 5 minutos.Nota: Cuando se utiliza un sistema de líquido, donde las células son cytocentrifuged los portaobjetos en solución, quite el sobrenadante después de citocentrifugación y aplicar un giro seco a 1140 x g durante 1 minuto. Proceder directamente a microdisección por láser o dejar el cytospins secar al aire durante la noche y la congelación de las muestras a-20 ° C para almacenamiento a largo plazo. Pipetee 4.5 μl de mezcla maestro de lisis de células en el tapón de un tubo PCR de 0.2 mL y cosechar las células mediante Microdisección láser. Recuperar el tubo PCR desde el microscopio de Microdisección láser y cierre el tubo. Recoger todo el líquido en la parte inferior del tubo de giro corto y coloque la muestra en hielo. Proceder con WGA unicelular o almacenar las muestras aisladas a-80 ° C durante 1 mes antes de proseguir. 6. adaptador-linker basado en genoma amplificación 18,19 Nota: Asegúrese de que todos necesarios Masters mixes (componentes de kit de WGA, tabla de materiales y reactivos) son preparados y almacenados en hielo listo para usar. Masters mezclas incluyen la mezcla de digestión de DNA 1 para micromanipulated muestras (véase 5.1.) (con 2.0 μL de tampón de reacción, 2.0 μL de Mseenzima de la restricción y 16.0 μL de agua libre de DNasa/Rnasa) o digestión de DNA mix 2 para Microdisección láser (ver 5.2). las muestras (que contiene 2.5 μl de Mseenzima de la restricción y 2,5 μl de agua libre de DNasa/Rnasa), previamente recocido master mix (contiene 5,0 μL de tampón de reacción, 5,0 μL de cada uno de los adaptadores PCR preannealing y 15.0 μL de agua libre de DNasa/Rnasa), ligadura de Master mix (contiene 30.0 μL de adaptadores PCR previamente recocidos, solución de adenosina trifosfato de 10.0 μL y 10.0 μL T4 ligasa solución) y primaria PCR master mix (contiene 30.0 μL de un buffer PCR, 20.0 μL de solución de mezcla de Deoxinucleótidos 10 mM 10.0 μL de una polimerasa mezcla y 340.0 μL de agua libre de DNasa/Rnasa). Todos los volúmenes se dan para la preparación de las 10 muestras. Ajustar en consecuencia el número de muestras. Por lisis celular, colocar las muestras de microdisección micromanipulated/laser en un termociclador y sola célula lysis de la célula a 42 ° C por 45 min, 65 ° C por 30 min y 80 ° C por 10 min de incubación.Nota: Use un termociclador con una tapa caliente. Lisis celular pueden hacerse O/N para 10 a 15 h. En ese caso, omita el paso de incubación a 65 ° C. Ejecute el recocido de los adaptadores de la polimerización en cadena. Por lo tanto, incubar la mezcla principal previamente recocida en un termociclador a 65 ° C durante 1 min seguido por otros 49 ciclos de 1 min cada uno, con progresiva disminución de la temperatura 1 ° c/ciclo. Después de 50 ciclos (a 15 ° C), incubar la mezcla principal a 15 ° C hasta su uso posterior.Nota: Este paso es necesario generar asimétricos adaptadores adecuados para ligadura (ver paso 6.6.) con sola célula ADN sometido a MseI recopilación de restricción. Después de la lisis celular, desactivación de las muestras sometidas a lisis a 2000 x g durante 3 s para recoger todo el líquido en la parte inferior y coloque en hielo. Para fragmentar el ADN, añadir 2 μl de la mezcla de digestión de DNA 1 a cada muestra micromanipulated sometidas a lisis o 0,5 μl de la digestión de ADN mezcla 2 a la muestra de Microdisección láser y ejecutar digest de restricción. Utiliza a un termociclador con tapa calentada a 37 ° C por 5 min seguido de una etapa de inactivación de la enzima de la restricción a 65 ° C durante 5 minutos.Nota: Digestión a 37 ° C puede extenderse a 3h. Este es el único paso de protocolo diferente entre las muestras obtenidas de micromanipulación y muestras obtenidas de Microdisección láser. Desactivación de las muestras a recoger todo el líquido en la parte inferior y coloque en hielo. Para la ligadura de restricción digerida ADN y adaptadores previamente recocidos, agregar 5,0 μL del master de ligadura mezclar a cada muestra de ADN digerido y ligar en un termociclador a 15 ° C durante 1 hora.Nota: Este paso puede ampliarse a 12 h o realizado O S/N. Desactivación de las muestras a recoger todo el líquido en la parte inferior y coloque en hielo. Para WGA añada 40.0 μL de mezcla maestra de primaria PCR a cada uno de los productos de ligadura y correr WGA en un termociclador con tapa calentada como sigue: primero, incubar las muestras a 68 ° C por 3 min. En segundo lugar, ciclo de 15 veces a 94 ° C durante 40 s, 57 ° C por 30 s y 68 ° C para 1 min 30 s + 1 s/ciclo. Luego añadir 9 ciclos a 94 ° C durante 40 s, 57 ° C + 1 ° C/ciclo durante 30 s, 68 ° C para 1 min 45 s + 1 s/ciclo. Después de eso, ciclo para 23 veces a 94 ° C durante 40 s, 65 ° C durante 30 s, 68 ° C para 1 min 53 s + 1 s/ciclo. Por último, realizar una extensión final a 68 ° C por 3 min 40 s y enfriar las muestras a 4 ° C. Desactivación de las muestras a recoger todo el líquido en la parte inferior y Compruebe la calidad de ADN o almacenar las muestras a-20 ° C o -80 ° C para almacenamiento a largo plazo. 7. control de calidad de los productos WGA Nota: Compruebe la calidad de los productos WGA basados en la gama del borrón de transferencia de ADN y el número de productos de amplificación después de ejecutar un 4plex QC-PCR 5. Ejecutar partes alícuotas WGA y respectivas muestras QC-PCR en un gel de agarosa al 1.0% para la evaluación. Preparación de soluciones madre de 100 μm de primers todo usados para el control de calidad de 4plex PCR (tabla 1). Añadir 8 μl de cada cebador a 136.0 μL de agua grado PCR para generar 200 μL de piscina de cartilla. Vórtice la solución durante 3 s, desactivación a 2000 x g durante 3 s y alícuota de 20 μl para el almacenamiento a-20 ° C. Kits PCR estándar de uso para preparar a un master de PCR multiplex mezclan que contiene 6.0 μL de 2 componentes x PCR (excepto imprimaciones), 4.5 μl de agua grado PCR y 0,5 μl de la piscina de la cartilla. Añadir 1,0 μL de los productos WGA y girar por PCR ejecución a 94 ° C por 2 min seguido de 35 ciclos de desnaturalización a 94 ° C por 1 min, primer recocido a 56 ° C durante 1 min y extensión de la cartilla a 72 ° C por 1 min 30 s y a un paso de extensión final a 72 ° C por 7 min la enfriar a 4 ° C, giran hacia abajo y coloque las muestras en hielo para gel de análisis el mismo día o a-20 ° C para su posterior análisis.Nota: Refrigeración en el termociclador puede realizarse a 12 ° C para aumentar la longevidad de los elementos de Peltier. Analizar productos WGA (obtenidos 6.8.) y respectivos 4plex QC-PCR en un gel de agarosa al5.

Representative Results

Las células después de CFSE y tinción nucleicos pueden evaluarse usando un microscopio de inmunofluorescencia equipado con filtros DAPI y FITC. Los núcleos presentan un contraste brillante en el canal DAPI mientras que el citoplasma de las células muestran etiquetado uniforme con CFSE con intensidad de entre célula heterogénea (figura 2A y 2E). Forma y coloración de intensidades similares son esperados de las células conectadas al cable (figura 2B y 2F) así como desprende el cable y recuperados en un portaobjetos (Figura 2D y 2 H). Las densidades de célula alta (por ejemplo > 1 000 000 células/mL) puede resultar en cobertura total del alambre con las células de carga de los cables. Sin embargo, reducir las densidades de célula, cambios en la velocidad de rotación durante la incubación y el uso de diferentes líneas celulares afectan la eficiencia de aislamiento y deben analizarse por separado. Cuando los cables se incubaron con 5 mL de células HT-29 en el de 100 000 células / mL como se describe en la sección 2.1., una media de 254 ± 103 células (n = 5) fueron capturados en los cables. Con el mismo experimento usando las células LNCaP, una media de 440 ± 319 células (n = 5) por cable se obtuvo. Presentar células HT-29 500, 5 000 y 50 000 en un fondo de 5 mL de sangre periférica a los cables (según protocolo de sección 2.2.) resultó en la captura de 75 ± 18 células, 25 ± 9 células y células ± 57 47 (n = 3, cada uno), respectivamente. Si el cable está cargado con 15 μl de suspensión celular (1 000 000 células/mL) según el protocolo en la sección 2.3., hasta 1 000 (HT-29) las células pueden unir a un cable. Eficiencias de separación osciló entre el 81% en las células HT-29 de la célula (gama 54,9% y 93.2% y n = 5) al 81% (gama 63.51% – 92.87%, n = 6) y el 91% (rango de 84,7% y 95,3%, n = 6) en LNCaP y VCaP células, respectivamente. Del mismo modo, la recuperación de células separadas difiere entre líneas celulares: una media de 28% de células HT-29 chalets fueron recuperados por citocentrifugación. Mientras que la tasa de recuperación de LNCaP fue inferior al 10%, la tasa de recuperación media para las células VCaP fue 55%. Aproximadamente el 75% de las células sometidas a productos de WGA WGA rendimiento de alta calidad: esto es 1) borrón de transferencia de productos WGA desde 0.1 a > 1 kb (figura 4, panel superior) y 2) tres o cuatro bandas de calidad 4plex controlan PCR (figura 4, panel inferior) . Productos WGA se pueden utilizar para 1) array-CGH perfiles cumplen con los criterios de calidad para single-cell array-CGH perfiles 6,7 y NGS 2) objetivo después de la amplificación WGA 7. Figura 1: flujo de trabajo para aislar y la recuperación de las células de la blanco para el análisis unicelular. (A) las células se cultivan para el 90% de confluencia y (B) cosechadas para obtener una suspensión unicelular. Después de la tinción con CFSE y mancha de nucleico, (C) el cable funcionalizado se incuba en presencia de las células en un volumen de 5 mL en tubos de reacción o en un volumen bajo, utilizando una pipeta Pasteur. Este último permite para aplicación de volúmenes de suspensión celular tan bajas como 15 μl. (D) células necesitan ser separadas dentro de 4 h después de la carga. Por lo tanto, el cable se coloca en un tubo de reacción de 1,5 mL con buffer de liberación. Después de la incubación de 15 minutos en un eje de balancín y centrifugación de 10 minutos, se retira el cable y la suspensión se centrifuga para que sedimenten las células. (E) recuperan las células son o transfiere a un portaobjetos de vidrio para micromanipulación unicelular (arriba) o cytocentrifuged un portaobjetos recubierto de membrana y remitió a láser microdissection (abajo). (F) finalmente, las células recolectadas se amplifican por medio de la amplificación del genoma (WGA). Productos WGA son compatibles con el array-CGH y objetivo análisis descendente de NGS. EpCAM epitopo: círculo verde en la superficie de la célula. Funcionalizados cable: dispositivo, de alambres helicoidal triple gris. Polímero: líneas moradas. Anticuerpos anti-EpCAM: naranja. Liberar la actividad buffer: flecha roja. Marcador de grasa para mantener la suspensión de células en su lugar: elipse azul oscuro. Recuperado de suspensión celular: azul claro. Capilares para micromanipulación: Negro línea. Ampliación: celular recuperado por micromanipulación, cytospin en membrana diapositiva que contienen células recuperadas (elipse llena gris). Ampliación: celular recuperado siendo láser microdissected (línea circular gris: membrana de diapositiva de membrana que sirven como columna vertebral para Microdisección láser), objetivo con láser (línea azul a la diapositiva de la membrana de abajo). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2: visualización de las células con. (A, E) Las células antes de la carga: las células son etiquetadas con CFSE y contratinción con un ADN intercalando tinte mostrando una intensidad de señal del rango de CFSE (verde). (B,F) Etiquetado células capturadas en el alambre. (C,G) De alambre después de procedimiento de separación celular. (D,H) Las células desprendidas de alambre y recuperaron por citocentrifugación en una diapositiva. CFSE: FITC el canal (verde). Tinción de DNA: canal DAPI (azul). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3: alambre y conservación compartimiento conservación. (A) los compartimientos del alambre. (B) detalle de la parte funcionalizada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 4: control de calidad de productos WGA obtenida de células micromanipulated solo. Panel superior: productos WGA obtenidos de células típicamente resultado en ADN los borrones de transferencia que van desde 0,2 kb > 1,0 KB con una intensidad de pico en alrededor de 0,5 kb. Frotis de muestras número 1, 7 y 13 (indicadas con asteriscos) Mostrar subóptima o no ADN. Panel inferior: WGA productos son de calidad suficiente si la PCR 4plex produce tres o cuatro de cuatro productos PCR (100, 200, 300 y 400 bp). Las muestras 1, 7, 10 y 13 muestran menos de tres bandas y sería excluidas de su análisis posterior. Carril M contiene una escalera de bp 100 y los asteriscos indican las muestras de calidad de producto insuficiente de WGA. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Secuencia de primer NOTA 5 gtt cca ata tga ttc cac cc-3 ‘ primer avance de 100 bp 5-ctc ctg gaa gat ggt Tag gg-3 ‘ primer revés de 100 bp mordaza de 5′-agg tgg agc TCG agc-3 ‘ primer avance de 200 bp 5-ttt ggt tgc gga aat gtc ct-3′ primer revés de 200 bp 5-agg tga gac att ctt gct gg-3 ‘ primer avance de 300 bp 5-tcc ley aac cag tca gcg tc-3 ‘ 300 cartilla reversa de bp 5-aca gtc gato gcc atc ley gc-3 ‘ primer avance de 400 bp 5-gct tga caa agt ggt cgt tg-3 ‘ primer revés de 400 bp Tabla 1: Secuencias de la cartilla para control de calidad 4plex PCR

Discussion

El protocolo descrito tiene como objetivo recuperar las células de un alambre funcionalizado (denominado dispositivo) para análisis genómico ex vivo unicelular. Probamos tres EpCAM positivo las líneas celulares (HT-29, LNCaP y VCaP), pero en principio, este método puede aplicarse a cualquier línea celular expresando EpCAM. Células diana EpCAM positivos pueden presentarse al dispositivo de suspensión celular puro (ver 2.1.) o mezclado en un exceso de células de fondo (por ejemplo. periférico sangre, ver 2.2.). Mientras que sobre todo este último podría utilizarse para probar la capacidad de aislamiento en condiciones raras de la célula, puesta a punto del número de las células conectado al cable puede hacerse usando el bajo volumen descrito acercamiento (ver 2.3.). Como diferencias entre las líneas celulares son de esperarse, densidad celular adecuado para cargar el cable, rotación velocidad, así como tiempo de incubación tiene que comprobarse empíricamente, evaluando el número de células conectados usando un microscopio de inmunofluorescencia.

Para aplicaciones posteriores genómicas a nivel unicelular WGA, se requiere. El método WGA de elección puede diferir entre laboratorios y, en principio, nuestro método está abierto a todos los métodos que puede manejar las muestras obtenidas de Microdisección láser o micromanipulación. En este protocolo, utilizamos un método basado en ADN fragmentado enzimáticamente debido a un mejor rendimiento en comparación con un calor-fragmentación basado en WGA7. Opcionales, solo las células pueden enviarse a WGA isotermo permitiendo posterior DNA profiling20,21.

El protocolo descrito tiene como objetivo recuperar las células intactas después de ser unido a una nueva generación de cables funcionalizados para análisis genómico unicelular. La primera generación de cables funcionalizados, que también representan a los dispositivos de enriquecimiento sólo CE-aprobados en vivo en el mercado hasta ahora, fueron utilizada para la enumeración de CTC en pacientes con metástasis de cáncer. Publicaciones anteriores y nuestros datos sugieren que la técnica de aislamiento en vivo para ser más sensibles en comparación con el estándar de oro actual tecnología2. Así, equipando esta técnica de aislamiento en vivo con una función de recuperación cuando se dio cuenta en el dispositivo permite combinar la alta recuperación CTC con la caracterización a nivel unicelular.

Sin embargo, no se borra el dispositivo para el uso en pacientes, por lo tanto, los datos clínicos no están disponibles. Aplicaciones ex vivo (es decir, aislar CTCs de la sangre periférica después de muestreo) no son recomendables como la tecnología se adapta a la configuración presente del cubital inútil, por ejemplo bajo diámetro del vano (aumento de la probabilidad de directa de contacto entre el CTC y los anticuerpos de captura) y tiempo de retención largo (30 minutos, permitiendo que 2-3 L de sangre pasar el cable). Sin embargo, como se describe en la sección 2.2. las células de blanco también pueden ser aisladas de muestras mixtas7.

Una limitación actual del método es la ineficiente recuperación de células no fijadas después de la separación de los cables. Esto, sin embargo, podría mejorarse mediante un paso de fijación de la célula antes del tratamiento de la separación.

En Resumen, este protocolo es un primer paso hacia el uso combinado de una técnica de aislamiento en vivo con la recuperación de la célula para caracterizar genéticamente las células. Sus esfuerzos tienen que abordar la optimización de la recuperación de la célula y espacio para su aplicación en pacientes de1,2. Sin embargo, la medicina personalizada para las decisiones de control y terapia de tratamiento es más allá de la enumeración de los CTC. Así, este método es un primer paso hacia la caracterización genómica de CTC en el nivel unicelular.

Aplicaciones para análisis de transcriptoma unicelular parecen factibles como se cosechan las células intactas. Sin embargo, queda por evaluar si el procedimiento de recuperación tiene un impacto sobre la integridad del RNA (e.g. expedición recuperado las células a la lisis directa seguida por RT-qPCR22). Si tiene éxito, caracterización de las células (por ejemplo, CTC) puede cambiar de puesto al nivel de transcriptoma, permitiendo análisis más detallados. En este sentido, RNA-seq usando Smart-Sec2 proporciona una herramienta valiosa para posterior análisis del ARN de las células como el cDNA activos (obtenido durante la preparación de la biblioteca de RNA-seq) puede ser sometido a la PCR cuantitativa. Esto permitirá un objetivo combinado y análisis basado en la proyección de las células recuperadas22,23.

Los actuales cables funcionalizados se basan en anticuerpos anti-EpCAM que es un marcador epitelial ampliamente utilizado para la selección positiva de CTC24. Como varios CTC downregulate marcadores epiteliales citoqueratinas como EpCAM25, añadiendo anticuerpos como HER2/nueva aumentaría las posibilidades de aislamiento de la CTC. Varios anticuerpos basado en enriquecimiento de estrategias han sido elaboradas y revisados por Ferreira et al. en el 201626. Una mezcla de anticuerpos inmovilizados en un alambre podría ser una futura mejora de la tecnología líder para el aislamiento de un número más alto y subtipos adicionales de CTC.

Es obligatorio para todos los pasos de alambre manipulación para mantener la parte funcional del alambre sumergido en la solución para mantener su funcionalidad. Le recomendamos que coloque el cable de 1 x PBS durante la evaluación (microscopio; por ej. 3.1 los pasos. -3.3.) y almacenamiento de información. Con el fin de evitar que se manchen inadecuado, recomendamos usar recién preparado solución de tinción en pasos 1.2.1. y 1.2.2. Células débil obstaculizan el celular con el cable y pueden llevar a la subestimación de las células adjuntas.

Es necesario evitar conectar la pipeta Pasteur con el tapón de goma al insertar el cable de la pipeta Pasteur para la posterior carga de la suspensión celular (paso 2.3.4.). El tapón de goma se utiliza para sostener el cable en su lugar para que la parte funcional se encuentra dentro de la punta de la pipeta de Pasteur. Si la tapa se une demasiado firmemente a la parte posterior de la pipeta de Pasteur, carga de la suspensión de células no es posible. En este caso, facilitar la tapa que el aire que es desplazado por la suspensión de células cargadas puede dejar la pipeta.

El cable de la flexión es fundamental para su orientación durante la célula contando pasos 3.2. y 3.3. Monte los cables con la cinta adhesiva, tal que al final no funcional del alambre viene a mentir a un lado. Después de la digitalización de toda la longitud de la parte funcional, el alambre se enrolla 180° por lo que la otra mitad del cable funcional puede digitalizarse. Este paso es importante para los experimentos iniciales determinar el número de células en el alambre. Una vez que se evalúa el número de células de un determinado procedimiento y línea celular, el procedimiento se puede repetir sin contar a la célula (ej. sólo comprobando la presencia de células u omitir este paso). Pipeteo cuidadoso es fundamental para evitar la pérdida de la célula al reducir el volumen del sobrenadante en el paso 4.8. Asegúrese de pipeteo se realiza suavemente sin causar turbulencias a la pelotilla.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este estudio fue financiado por el fondo austriaco de ciencia (FWF), proyecto no. Me 1220-B19 (para PS) como parte del Proyecto ERANET en cáncer traslacional investigación (TRANSCAN) “Células tumorales de circulación como biomarcador para la enfermedad Residual mínima en cáncer de próstata (CTC-SCAN)”. Candidato a doctor S.C. fue entrenado en el marco de la Medicina Molecular del programa de doctorado de la Universidad médica de Graz. Los autores reconocen con gratitud Nina Schlögl, Daniel Kummer, Gabi Wendt, Claudia Chudak, Julia Schulz y Johanna Schiller su asistencia técnica experta. Los autores agradecen a Georg Peinhaupt para apoyo de diseño gráfico.

Materials

Gilupi Release Buffer Gilupi GIL083 Used to detach cells from the wire
McCoy's 5A Medium (1x) suppl. with L-Glutamine Thermo Fisher Scientific 16600-082 Culture medium used for HT-29 cells, adapt culture medium to cell line used for the experiments
HEPES Buffer Solution (1 M) PAA S11-001 Supplement for McCoy's 5A Medium
Foetal Bovine Serum Gold PAA A15-151 Supplement for McCoy's 5a Modified Medium
Penicillin-Streptomycin (100x) Biowest L0018-100 Supplement for McCoy's 5a Modified Medium
Phosphate Buffered Saline (1x PBS) Thermo Fisher Scientific 10010-015
Accutase Biowest L0950-100 Cell detachment solution (cell culture)
Water bath GFL Type 1003 Used for prewarming solutions
Incubator Thermo Fisher Scientific Used to incubate cells (cell culture)
50 mL reaction tubes VWR 525-0403
Roller mixer Stuart Scientific SRT6D Used to attach cells to the wire while keeping the cells from sedimenting
CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit Thermo Fisher Scientific C34554 Used to label living cells (cytoplasmic label)
Hoechst 33342 H3570 Thermo Fisher Scientific Used to stain DNA (nucleic counterstain)
Centrifuge (equipped for holding 15 mL and 50 mL reaction tubes) Thermo Fisher Scientific Heraeus Megafuge 40R Used for pelleting cells
Observer Z1 (Fluorescence/laser microdissection microscope) Carl Zeiss Microimaging Inverted (immunofluorescence) microscope capable of laser microdissection; Fluorescence microscopes must be able to detect Hoechst 33342 (DAPI filter) and CFSE (FITC filter)
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A4503-50G Used for coating glass/plastic surfaces
MS1 Minishaker Sigma-Aldrich Z404039 Used for vortexing
Vacutainer EDTA (or Na-heparin) tubes BD 366450 (or 366480) Used as reaction tube for ex vivo capture of target cells
Detektor CANCER03 DC03 Gilupi GIL003 Functionalized wire capable of isolating and detaching EpCAM-positive cells (also referred to as catch&release, C&R)
Syringe needles (G20) VWR 613-0554 Used to puncture rubber caps in order to allow the non-functional part of the C&R to lead through it
Neubauer chamber Roth T729.1 Used to count cells
Pasteur pipettes 150 mm Volac D810 Used for the low-volume application of cells to the C&R
Grease pen Dako S2002 Used on glass slides to hold cell suspension in place
Steril syringe filter (0.2 µm) Corning 431219 For filtering freshly prepared Gilupi Release Buffer
Delfia PlateShaker Perkin Elmer 1296-003 Used for agitation during cell detachment
1.5 mL tubes Eppendorf 30,125,150
Ampli1 WGA Kit Silicon Biosystems To be ordered via Silicon Biosystems
Axiovert M200 equipped with Mikromanipulator MMJ and CellTram vario Zeiss/Eppendorf Use micromanipulation at hand
Microcapillaries (25 µm in diameter), CustomTip Type I Eppendorf 930001201 Used for micromanipulating cells
0.2 mL PCR tubes Biozym 710920
Cytocentrifuge and equippment Hettich Universal 32 Use cytocentrifuge at hand
Thermo cycler Bio-Rad DNA Engine Dyad Every thermo cycler with heated lid can be used
Microcentrifuge Roth CX73.1 Use desk-top centrifuge at hand
MembraneSlide 1.0 PET Zeiss 415101-4401-050 Membrane-coated glass slides used for laser microdissection
UV Stratalinker 1800 Stratagene 400072 Use DNA cross linker at hand
Standard PCR reagents
6x DNA Loading Thermo Fisher Scientific R0611 Use gel loading dye at hand
DNA ladder BioLabs N0551G Use 100 bp ladder at hand
Agarose Biozym 840004
Gel electorphoresis station Bio-Rad Use electrophoresis system at hand
Gel Red Nucleic Acid Stain Biotium 41003 Intercalating dye for DNA visualization In agarose gels
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References

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Chen, S., El-Heliebi, A., Schmid, J., Kashofer, K., Czyż, Z. T., Polzer, B. M., Pantel, K., Kroneis, T., Sedlmayr, P. Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization. J. Vis. Exp. (135), e56394, doi:10.3791/56394 (2018).
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