Widerstand gegen Krebs-Therapien trägt zum Fortschreiten der Erkrankung und Tod. Bestimmung der mechanistischen Grundlagen des Widerstands ist entscheidend für die Verbesserung der therapeutischen Antwort. Dieses Manuskript Details des Protokolls Taxan-resistente Zellmodelle von Prostatakrebs (PC) zu helfen, sezieren die Wege erzeugen Progression zu Docetaxel Widerstand bei PC Patienten beteiligt.
Mikrotubuli targeting Agents (MTAs) sind eine tragende Säule bei der Behandlung einer Vielzahl von Tumoren. Erworbener Resistenz gegen Chemotherapeutika ist jedoch ein gemeinsamer Mechanismus des Fortschreitens der Krankheit und eine prognostische Faktor-Funktion von bösartigen Tumoren. Bei Prostatakrebs (PC) diktiert Widerstand gegen die MTAs wie Taxan Docetaxel Therapieversagen sowie Entwicklung hin zu tödlichen Stadien der Krankheit, die durch eine schlechte Prognose und hohen Sterblichkeitsraten definiert sind. Obwohl seit Jahrzehnten erforscht, das Array von Mechanismen zur erworbene Resistenz nicht vollständig verstanden, und somit eine erhebliche Einschränkung für die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien, die Patienten in diesen fortgeschrittenen Stadien der profitieren könnten Erkrankung. In diesem Protokoll beschreiben wir die Generation der Docetaxel-resistenten Prostatakrebs-Zelllinien, die tödliche Funktionen von fortgeschrittenen Prostatakrebs zu imitieren, und können daher verwendet werden, um die Mechanismen zu studieren durch die erworbenen Chemoresistenzen entsteht. Trotz möglicher Einschränkungen, die untrennbar mit einer zellbasierten Modell, z. B. den Verlust der Eigenschaften im Laufe der Zeit die Docetaxel-resistente Zelllinien durch diese Methode produziert haben in den letzten Studien erfolgreich eingesetzt und bieten die Möglichkeit, vorab unsere molekularen Verständnis der erworbenen Chemoresistenzen in tödlichen Prostatakrebs.
Eine erhöhte Rate der Verbreitung verursacht durch den Verlust der Kontrolle des Zellzyklus ist ein Markenzeichen von Krebs1. Diese funktionale Eigenschaft macht Krebszellen eindeutig abhängig von der Treue der Zellzyklus Schlüsselprozesse während S – und M-Phase, was führte zur Entwicklung der verschiedenen Zellzyklus sind Medikamente, die DNA-Schädigung oder mitotische Mängel zu induzieren. Obwohl zahlreiche Anti-mitotische Agenten wie Inhibitoren der mitotischen Kinasen oder Motorproteinen, derzeit entwickelt und getestet in klinischen Studien sind, weiterhin ältere Mikrotubuli targeting Agents (MTAs) der einzige klinisch zugelassenen Ansatz für Ausrichtung auf die Mitose in Krebs2,3,4. MTAs entweder destabilisieren (Vinblastin, Vincristin, Vinorelbin) oder (Taxan-abgeleitete Agenten Paclitaxel, Docetaxel oder Cabazitaxel) Mikrotubuli zu stabilisieren und dadurch verhindern, dass die Bildung eines funktionierenden mitotischen Spindel5,6. Diese Agenten auslösen der Spindel Baugruppe Checkpoint7,8, die zu einer längeren mitotischen Verhaftung und späteren Zelltod in kultivierten Zellen9,10 und mitotischen Mängel in Tumoren11 führt ,12 und sind daher nützlich für die Behandlung von verschiedensten Krebsarten, darunter Prostatakrebs13.
Prostatakrebs ist die am häufigsten diagnostiziert Krebs und eine führende Ursache von Krebs verursachten Todesfälle bei Männern14. Antimitotic Mittel wie Docetaxel verbessert Prostatakrebs Patienten überleben und sind eine tragende Säule bei der Behandlung dieser Krankheit15,16,17. Leider, trotz anfänglichen Tumorschrumpfung Tumorzellen oft entwickeln Resistenzen während der Behandlung. Verschiedene zelluläre Mechanismen waren verwickelt, bei der Entstehung von der Entwicklung der Therapie, einschließlich Deregulierung der Apoptotic und entzündlichen Bahnen oder Aktivierung/Überexpression des Efflux Medikamentenpumpen wie der ATP-bindende Kassette transporter P-Glykoprotein (P-Gp/ABCB1), von denen die Letztere führt auf den Export von Chemotherapeutika aus Zellen18,19. Resistenz gegen Taxane ist auch verbunden worden mit anderen Ursachen, wie z. B. Veränderungen in der Expression von Tubulin Klassen oder Tubulin Mutationen, die Interaktion zwischen dem Medikament und seine Ziel 20,21zu verhindern. Darüber hinaus hat Widerstand Genom Instabilität Anhäufung und Tumor Heterogenität22,23verwandt worden. Allerdings sind die Mechanismen, die einen Beitrag zur Taxan Widerstand nicht vollständig verstanden die ist offensichtlich durch das Fehlen von Therapiestrategien, die sein Aussehen zu verhindern. Daher ist dringend notwendig, experimentelle Modelle, die helfen in der Dissektion dieser Mechanismen zu generieren und neue therapeutische Ansätze zu identifizieren, die die Entwicklung von Resistenzen gegen diese Medikamente zu verhindern.
In diesem Artikel beschreiben wir eine Methode, die die Generation der Docetaxel-resistente (DR) Prostata-Krebszellen ermöglicht. Gewusst wie: Überprüfen Sie den Status der Widerstand dieser Zellen mit Kolonie Bildung Assays und quantitative RT-PCR werden weiter beschrieben. Zellen, die durch diese Methode produziert haben den Vorteil der Rekapitulation viele von der molekularen Eigenschaften in öffentlich zugänglichen menschlichen Tumor Beispieldatenbanken mit dem zusätzlichen Vorteil der Bereitstellung der Vielseitigkeit um über eine Vielzahl von experimentellen Tests durchführen längere Zeit als von Tumorproben zulässig. Dieser Krebs-Modelle von Therapieresistenz können für viele Wochen in der Gewebekultur und unter anderem erweitert werden, genetisch manipuliert, durch Mikroskopieverfahren visualisiert und analysiert werden können Genexpression. Darüber hinaus können sie Xenotrasplanted bei Mäusen, weitere Auswirkungen im Tumor Bildung und das Wachstum in Vivozu analysieren sein. Derzeit ist die wichtigste alternative Methode Resistenzen in Zusammenhang mit Prostatakrebs zu studieren die direkte Analyse von Tumorproben. Während diese Proben ein sehr potentes System zum Sammeln von Informationen über Genexpression und des Status der bestimmten Tumoren vorhanden, Zugang zu ihnen kann sehr begrenzt und sie sind schwer zu halten für weitere Manipulationen und experimentelle Analyse, die kann leicht mit der Zell-Linien generiert mit diesem Protokoll24,25erfolgen. Wichtig ist, nähert sich in der Zukunft Alternative wie z. B. die Erzeugung von menschlichen abgeleiteten Organellen direkt vom Patienten wäre ein sehr mächtiges Werkzeug und Alternative zu den derzeit Methode26,27. Da sie in einem 3D Kontext rekapitulieren werden, was ein Tumor in seiner ursprünglichen Umgebung war, werden Organellen das perfekte Modell zwischen Zell-Linien und menschlichen Tumoren. In diesem Protokoll beschriebenen experimentellen Zelle Modelle sind jedoch immer noch erschwinglicher zu pflegen und für schnellere Analyse geeignet. Die Ergebnisse, die durch das Studium dieser Zelllinien können hochgerechnet auf und bestätigt in Humanproben und 3D Kulturen. Daher kann dieses Protokoll sein Interesse für Forscher suchen Zellmodelle Chemoresistenzen Mechanismen in jede Zelllinie zu studieren, da unser Protokoll an die Studie von anderen Drogen und Krebs-Typen angepasst werden kann. Die hier beschriebenen Methoden sind leicht zu tragen in jedem Labor, erschwinglich und lassen Vorstudien der molekularen und zellulären Mechanismen der Resistenz.
In diesem Manuskript beschreiben wir eine Methode um Docetaxel-resistenten Prostatakrebs Modell Zellsysteme zu generieren, die für die Untersuchung der Mechanismen, die zur Übernahme des Phänotyps Therapie ermöglicht. Während dieser Ansatz höchst zuverlässig und reproduzierbar ist, einige möglichen Einschränkungen zu berücksichtigen. Da nur ein Bruchteil der Masse Bevölkerung der Zellen Chemoresistenzen28ausstellen werden, es empfiehlt sich, mit einer großen Population von Zellen beginnen (wir Platte in der Regel 20 Fläschchen 150 cm2, die entfallen ca. 1,2 x 108 (Zellen). Wichtige Schritte des Protokolls für den Erfolg des Verfahrens zu berücksichtigen. Erstens ist es sehr wichtig, verwenden die gleichen Docetaxel Lager für lange Laufzeit Nutzung (10 mM Lager Aliquote können für verwendet werden, Jahre, wenn Sie ordnungsgemäß in bei-80 ° C gelagert) frisch zubereitet. Geringfügige Änderungen in der Docetaxel aliquoten können die Ergebnisse der IC50, Generierung von Zelle Zeile Timing und die Kolonie Bildung Ergebnisse auswirken. Zweitens ist es entscheidend, das Protokoll, die Bestimmung der IC50 in jeder einzelnen Zelle Zeile, da Variationen auftreten können, wenn Sie eine neue Charge von Zellen zu verwenden zu beginnen. Drittens: unbedingt darauf achten, dass die medikamentöse Behandlung wirksam ist durch Überprüfung Zellen unter dem Mikroskop häufig, so dass eventuelle Fehler schnell erkannt und korrigiert werden können. Zu guter Letzt empfehlen wir immer einen Vorrat an Zwischenschritte im Falle einer Verschmutzung oder unerwartete Probleme, die die Lebensfähigkeit der Zellen in der Mitte des Protokolls auswirken könnten. Wichtig ist, unser Protokoll Modelle von Resistenzen zu erzeugen, indem man Prostatakrebszellen zu hohe Dosen von Docetaxel für 72 h, gefolgt von langen Erholungsphasen, anstatt niedrigeren konstanten Konzentrationen des Medikaments in einem Versuch, das beste zu imitieren soll klinische Szenario für Prostatakrebs Behandlung mit diesem Taxan Agent15,16gemeldet.
Darüber hinaus ist darauf hinzuweisen, dass resistente Zellen zeigen eine hohe Plastizität, die im Laufe der Zeit zu einem fortschreitenden Verlust der erworbenen Resistenz Eigenschaften führen können. Erweiterung der Nutzung dieser Zellen länger als 2-3 Monate in der Kultur wird daher nicht empfohlen. Wenn eine permanente Versorgung benötigt wird ist es ratsam, ständig neue Chargen von resistenten Zellen generieren. Jedoch wenn Chargen von Zellen über einen längeren Zeitraum kultiviert wurden, können Kolonie Bildung Assays und qPCR verwendet werden, ihren Widerstand zu überdenken. Eine weitere Alternative ist die abnehmenden Widerstand Förderung durch die Behandlung der Zellen mit einer hohen Dosis von Docetaxel für 72 h (500-1.000 nM). Nach einer Erholungszeit von ein bis zwei Wochen kann der Phänotyp erneut durch qPCR und Kolonie Bildung getestet Assays. Es ist auch möglich, jedoch nicht empfohlen, Aliquote der behandelten Zellen in flüssigem Stickstoff (in FBS, 10 % DMSO) zu speichern. Bitte beachten Sie, dass nach einem Frost-Tau-Zyklus der Chemoresistenzen Phänotyp immer mit den vorgenannten Methoden neu bewertet werden sollte.
Trotz dieser Vorbehalte wir28,29 u.30,31,32,33 konnten erfolgreich einsetzen diese Modellsysteme, zelluläre Schlüssel Roman zu identifizieren und molekulare Mechanismen führen zu erhöhten Tumor-initiierenden Kapazität, Zelle überleben und Aggressivität in Docetaxel-resistenten Zellen. Mit diesen Krebs Zelle Modellsystemen entdeckten wir Zellen ausstellenden eine undifferenzierte Phänotyp, gekennzeichnet durch das Fehlen von epithelialen und Prostata-bezogene Differenzierung Marker und Überexpression von den Entwicklungsstörungen (Kerbe und Hedgehog) Signalwege, überleben chemotherapeutischen Exposition28. In einer zweiten Studie aufgedeckt mit diesen Modellen zusammen mit öffentlich zugänglichen Patienten gen Datensätze24,25, wir, dass Pioneer Transkriptionsfaktors GATA2 hoch in metastasiertem Kastration-resistente überexprimiert ist Chemotherapie-resistenten Prostatakrebs-Zellen. GATA2 erhöht das Überleben der Zellen durch eine IGF2-abhängige nachgeschalteten Kinase Signalisierung Netzwerk29direkt aktivieren. Vor allem, diese Studien dazu beigetragen, neuartige Schlüsselrollen von GATA2 in fortgeschrittenem metastasierendem Prostatakrebs Aggressivität34zu identifizieren.
Die Entwicklung von Resistenzen ist ein Problem, das nicht nur auf Docetaxel und Prostatakrebs, wie es unter vielen anderen Arten von Krebs mit einer Vielzahl von chemotherapeutischen Medikamenten behandelt. In der Tat gelten ähnliche Einschränkungen der Verfügbarkeit des experimentellen Modellen, und es ist denkbar, dass unser Protokoll an anderen Krebsarten und ihre jeweiligen Chemoresistenzen Mechanismen untersuchen angepasst werden kann.
Die Generation der Docetaxel-resistenten Zellen wie in diesem Protokoll beschrieben dient als ein funktionales Werkzeug, um neuartige relevanten molekulare und zelluläre Mechanismen der Chemoresistenzen zu identifizieren. Dies öffnet die Tür zu finden, neue Ziele, auf denen die Entwicklung neuer Therapien bei hochmalignen Prostatakrebs die Grenzen einmal mehr artikulieren könnte, was wir über diese Krankheit wissen und wie wir ihre Patienten behandeln.
The authors have nothing to disclose.
GERADE-B. erhält Mittel aus dem US Department of Health & Human Services, NIH, National Cancer Institute gewähren Nummer 1 K22 CA207458-01 und J.D-D. wird gefördert vom US Department of Health & Human Services, NIH, National Cancer Institute gewähren Nummer 1 R01 CA207311-01.
DU145 cells | ATCC | HTB-81 | |
22Rv1 cells | ATCC | CRL-2505 | |
Docetaxel | Selleck Chemicals | S1148 | in DMSO (10mM) |
Tissue culture flask 150cm2 | Falcon | 355001 | |
6-well tissue culture plates | Falcon | 353046 | |
RPMI 1640 Medium | Gibco | 11875093 | Supplemented with 10% FBS and 1% Penicilin/Streptomycin |
Foundation B Fetal Bovine Serum | Gemini | 900208 | |
1X Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-040-CM | |
0.05%Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-062 | |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74106 | |
SuperScript III first strand synthesis system for RT-PCR | Invitrogen | 18080051 | |
Power SYBR Green PCR Master Mix | Invitrogen | 4367659 | |
Crystal Violet | Sigma-Aldrich | C0775 | |
10% Formalin Solution | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
Primers for qRT-PCR: | Life technologies | ||
CK19 F: CTGCGGGACAAGATTCTTGGT | |||
CK19 R: CCAGACGGGCATTGTCGAT | |||
CDH1 F: GGAAGTCAGTTCAGACTCCAGCC | |||
CDH1 R: AGGCCTTTTGACTGTAATCACACC | |||
ABCB1 F: TGTTCAAACTTCTGCTCCTGA | |||
ABCB1 R: CCCATCATTGCAATAGCAGG | |||
GATA2 F: CATCAAGCCCAAGCGAAGA | |||
GATA2 R: TTTGACAGCTCCTCGAAGCA | |||
ACTIN F: CATGTACGTTGCTATCCAGGC | |||
ACTIN R:CTCCTTAATGTCACGCACGAT |