Summary

G2-seq: Un'elevato Throughput sequenziamento-base tecnica per identificare replica ritardata regioni del genoma

Published: March 22, 2018
doi:

Summary

Descriviamo una tecnica per combinare la citometria a flusso e sequenziamento ad alta per identificare regioni tarda replicazione del genoma.

Abstract

Numerose tecniche sono state sviluppate per seguire l’avanzamento della replica del DNA attraverso la fase S del ciclo cellulare. La maggior parte di queste tecniche sono state dirette verso delucidazione della posizione e la tempistica di apertura di duplicazione del genoma piuttosto che il suo completamento. Tuttavia, è fondamentale che capiamo regioni del genoma che sono ultima per completare la replica, perché queste regioni soffrono i livelli elevati di rottura cromosomica e mutazione, e sono stati associati con la malattia e invecchiamento. Qui descriviamo come siamo ad una tecnica che è stata utilizzata per monitorare l’inizio di replica per invece identificare quelle regioni del genoma Ultima replica completa. Questo approccio si basa su una combinazione di citometria a flusso e sequenziamento ad alta. Anche se la relazione si concentra sull’applicazione di questa tecnica di lievito, l’approccio può essere utilizzato con tutte le celle che possono essere ordinate in un citometro a flusso in base al contenuto di DNA.

Introduction

In più siti discreti, chiamati origini di replicazione, da cui la replica forcelle procedere in entrambe le direzioni (rivisto in Fragkos et al., 20151) viene avviata la replica del genoma eucariotico. Origini variano nella loro tempistica e l’efficienza di cottura, e sono state sviluppate diverse tecniche per monitorare l’attività di origine di replica e delucidare le cause di questa variazione. L’attività delle singole origini può essere dedotto dai livelli di single-stranded DNA2, che si forma intorno origini attivi, o utilizzando 2D elettroforesi del gel per monitorare specifiche replica intermedi3, entrambi i quali possono essere rilevati con sonde radioattive. Entrambe queste tecniche sono più facilmente applicate in S. cerevisiae rispetto in cellule di mammifero, perché origini sono limitati a specifiche sequenze conosciute nel precedente. Con l’avvento dei microarray, è diventato possibile valutare origine sparando a livello globale. Questo è stato fatto prima di etichettatura del DNA con gli isotopi pesanti, rilasciando le cellule da un blocco di G1 in medi contenenti isotopi leggeri e monitoraggio quindi la formazione di pesante-leggero ibrido DNA attraverso il genoma4. L’introduzione di sequenziamento ad alta permesso simili genoma monitoraggio dell’attività di origine senza l’obbligo di etichettatura isotopica costosi. Le cellule sono state ordinate in un citometro a flusso in base al contenuto di DNA e il loro DNA sottoposti a sequenziamento profondo. Perché copertura sequenza procede da 1x a 2x nel corso della fase S, tempo di replicazione relativa può essere valutata confrontando la lettura profondità delle cellule in fase S a quelli in G1 o G25,6. Queste tecniche, in particolare applicate ai lieviti, ha portato ad una più profonda comprensione di come sequenza di DNA, struttura della cromatina e DNA replica proteine regolano la efficienza e la tempistica di origine.

L’inizio non solo successo della replicazione del DNA, che si svolge alle origini, ma anche il completamento della replica, che si verifica dove si incontrano le forcelle replica richiede fedele trasmissione dell’informazione genetica durante la proliferazione cellulare. Come l’inizio della replica, i tempi di completamento della replica variano in tutto il genoma con alcune regioni restanti non replicate anche tardi nel ciclo cellulare. Tali regioni possono essere particolarmente distante dalle origini di replicazione attiva o possono contenere sequenze o strutture di cromatina che ostacolano la polimerasi del DNA. Replica ritardata regioni possa manifestarsi come siti fragili, che sono associate con rottura cromosomica e più elevati tassi di mutazione e sono stati implicati nel cancro e invecchiamento7,8,9. Tuttavia, nonostante l’importanza del corretto completamento della replica del DNA nel mantenimento della stabilità del genoma, la nostra comprensione di come e dove questo avviene è rimasta lontano dietro quella dell’iniziazione di replica. E mentre singoli geni cui replica tarda è stata associata con la malattia sono stati studiati con, ad esempio, qPCR10globali studi rivolti a chiarire le posizioni e cause di ritardo replica sono mancati. Qui descriviamo una tecnica che ci si riferisce a come “G2 seq” in cui uniamo la citometria a flusso con sequenziamento ad alta per far luce sul completamento della replicazione del genoma in lievito11. Con modifiche minori, il presente protocollo può essere adattato a tutte le celle che possono essere ordinato flusso in base al contenuto di DNA.

Protocol

1. preparazione delle cellule per flusso Cytometry ordinamento Inoculare provette da 15 mL contenente 8 mL di brodo YEPD tale che le culture raggiungono una densità di 5 x 106 a 1,5 x 107 cellule per mL dopo crescita durante la notte (vedi discussione Nota 1). Rotazione verso il basso le cellule di lievito (1.400 x g, a temperatura ambiente o a 4 ° C) in una provetta da centrifuga da 15 mL tappo a vite per 5 min, risospendere le cellule in 1,5 mL di etanolo al 70% e trasferirlo…

Representative Results

Abbiamo utilizzato la procedura descritta sopra per identificare siti tardi replicanti in lievito. Questo approccio utilizzando una regione conosciuta di replicante tardiva su un cromosoma artificiale di test hanno dimostrato che la tecnica per essere precisi e affidabili. I nostri risultati hanno dimostrato anche l’importanza biologica di tempestivo completamento della replica mostrando che una tardiva replicante regione sul cromosoma 7, che abbiamo identificato come fine la replica in b…

Discussion

Mentre questa tecnica è robusta e relativamente dritto in avanti, particolare attenzione deve essere rivolta al seguente:

(1) si consiglia che culture crescono per almeno 12 ore prima che raggiungano la fase di log, poiché le differenze si manifestano nel ciclo cellulare distribuzioni se culture vengono vendemmiate, dopo aver raggiunto la densità desiderata solo 4 h dopo l’inoculazione. La nostra ipotesi sono che una distribuzione del ciclo cellulare che ha raggiunto un equilibrio relativam…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato supportato da grant GM117446 NIH di A.B.

Materials

YeaStar Genomic DNA kit Genesee Scientific 11-323
1 µM SYTOX Green ThermoFisher 57020 resuspend in 50 mM sodium citrate, pH 7.2
50 mM sodium citrate, pH 7.2
RNase solution (0.25 mg / mL) Sigma R6513 0.25 mg / mL RNaseA resuspended in 50 mM sodium citrate, pH 7.2, boil RNase solution for 10 minutes before the first use only, and from then on store at -20°
proteinase K solution (20 mg / mL) ThermoFisher / Invitrogen 25530-015 resuspend in 10 mM Tris, pH 7.5, 2 mM CaCl2, 50% glycerol, store at -20°C
Model 50 Sonic Dismembrator Fisher Scientific FB50A220
BD Biosciences FACSAria II BD Biosciences 644832
Zymo-spin III columns Zymo Research C1005
Qubit dsDNA HS Assay Kit ThermoFisher Q32851
Qubit 3.0 Fluorometer ThermoFisher Q33216
Covaris Model LE220 Focused-Ultrasonicator Covaris 500219
Illumina TruSeq DNA LT Sample Prep Kit Illumina 15026486
Illumina HiSeq 2500 instrument Illumina SY–401–2501 
gsnap alignment software open source software / Genentech http://research-pub.gene.com/gmap

References

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Cite This Article
Foss, E. J., Lao, U., Bedalov, A. G2-seq: A High Throughput Sequencing-based Technique for Identifying Late Replicating Regions of the Genome. J. Vis. Exp. (133), e56286, doi:10.3791/56286 (2018).

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