G2-seq: תפוקה גבוהה המבוססת על רצף טכניקה לזיהוי מאוחר לבצע שיכפול אזורים בגנום
Summary
אנו מתארים שיטה לשילוב cytometry זרימה ורצף תפוקה גבוהה כדי לזהות אזורים שכפול מאוחר של הגנום.
Abstract
טכניקות רבות פותחו כדי לעקוב אחר ההתקדמות של שכפול ה-DNA באמצעות שלב S של מחזור התא. רוב שיטות אלה מכוונת כלפי הבהרה של המיקום והעיתוי של חניכה של שכפול גנום ולא להשלמתו. עם זאת, קריטי כי אנחנו מבינים אזורים בגנום כי הם אחרון להשלמת השכפול, כי אזורים אלה סובלים רמות גבוהות של כרומוזומלית, מוטציה, הם קושרו עם מחלה והזדקנות. כאן נתאר איך הרחבנו את טכניקה בה נעשה שימוש כדי לפקח על שכפול חניכה במקום לזהות אזורים אלה של הגנום אחרונה על שכפול מלאה. גישה זו מבוססת על שילוב של cytometry זרימה ורצף תפוקה גבוהה. למרות הדו ח מתמקד היישום של טכניקה זו שמרים, הגישה ניתן להשתמש עם כל התאים ניתן למיין ב cytometer זרימה לפי תוכן ה-DNA.
Introduction
שכפול גנום האיקריוטים מאותחלת באתרים נפרדים מרובים, שנקרא מקורותיה של שכפול, בשכפול אילו מזלגות להמשיך בשני הכיוונים (שבתוך Fragkos. et al., 20151). המקורות נבדלים הן שלהם העיתוי ואת היעילות של ירי, מספר טכניקות פותחו כדי לעקוב אחר פעילות מקור שכפול, להבהיר את הסיבות של וריאציה זו. הפעילות של המקורות הבודדים שניתן להסיק מן רמות של דנ א חד גדילי2, המהווה סביב מקורות פעילים, או באמצעות דו-ממדית בג’ל כדי לפקח על שכפול ספציפי ביניים3, אשר שניהם להיות מזוהה עם הגששים רדיואקטיבי. שניהם של טכניקות אלה יוחלו ביתר קלות לפי cerevisiae ס מאשר בתאי יונקים, כי מקורות מוגבלים ספציפית ידועים רצפי לשעבר. עם כניסתו של מיקרו-מערכים, זה הפך אפשרי להעריך מקור ירי באופן גלובלי. זה נעשה לראשונה על ידי תיוג DNA עם איזוטופים כבדים, שחרור תאים בלוק G1 לתוך בינוני המכיל אור האיזוטופים, וניטור ואז היווצרות של כבד-אור היברידית DNA ברחבי הגנום4. המבוא של רצפי התפוקה גבוהה מותר הגנום כולו דומה ניטור של מקור פעילות ללא הדרישה של תיוג איזוטרופי יקר. התאים היו ממויין של cytometer הזרימה על פי תוכן ה-DNA ו- DNA שלהם נתון רצף עמוק. בגלל רצף כיסוי בהתאמה מ 1 x 2 x במהלך שלב S, תזמון שכפול יחסית יכול להיות מוערך על ידי השוואת בעומק קריאה של תאים בשלב S לאלה ב- G1 או G25,6. שיטות אלה, במיוחד שהוחל שמרים, הובילה הבנה עמוקה יותר של כיצד רצף הדנ א הכרומטין, חלבונים שכפול ה-DNA להסדיר מקור תזמון ויעילות.
הנאמן והעברת מידע גנטי במהלך ההפצה הסלולר מחייב חניכה לא רק מוצלח של שכפול ה-DNA, באישון מוצאו, אלא גם סיומו המוצלח של שכפול, אשר מתרחשת שבו נפגשים מזלגות שכפול. כמו חניכה של שכפול, העיתוי של השלמת השכפול משתנה לאורך הגנום עם אזורים מסוימים שנותרו unreplicated אפילו מאוחר במחזור התא. אזורים כאלה עשויים להיות רחוקים במיוחד ממוצא שכפול active או עשוי להכיל רצפים או מבנים כרומטין הפוגעים דנ א polymerases. מאוחר לבצע שיכפול אזורים עלולים להתבטא כמו אתרים שבירים, אשר משויכות כרומוזומלית וקצבי מוטציה גבוהה יותר, היו מעורבים בסרטן, הזדקנות-7,–8,–9. עם זאת, למרות החשיבות של השלמה נאותה של שכפול ה-DNA בתחזוקה של יציבות הגנום, ההבנה שלנו של איפה ואיך זה מתרחש יש פיגרה של שכפול חניכה. בעוד גנים בודדים שכפול מאוחר אשר שויכה המחלה נחקרו עם, למשל, qPCR10, מחקרים הכללית מכוונת שחקרתי את המיקומים, שבבסיס גורם של המנוח מחסירה שכפול. כאן נתאר טכניקה שאנו מתייחסים כאל “G2 seq” שבו אנו משלבים cytometry זרימה עם תפוקה גבוהה רצף לשפוך אור על השלמתו של שכפול גנום של שמרים11. עם שינויים קלים, ניתן להתאים פרוטוקול זה תאים שניתן זרימה ממוין על פי תוכן ה-DNA.
Protocol
Representative Results
Discussion
טכניקה זו היא חזקה, יחסית ישר קדימה, תשומת לב מיוחדת צריכה להיות מוקדש הבאות:
(1) אנו ממליצים כי תרבויות לגדול במשך לפחות 12 שעות לפני שהם מגיעים שלב יומן, שכן ההבדלים באה לידי ביטוי מחזור התא הפצות אם תרבויות נקצרים לאחר שהגיעו ה הרצוי צפיפות 4 רק לאחר חיסון. ההנחה שלנו היא כי הת…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענק NIH GM117446 א.
Materials
| YeaStar Genomic DNA kit | Genesee Scientific | 11-323 | |
| 1 µM SYTOX Green | ThermoFisher | 57020 | resuspend in 50 mM sodium citrate, pH 7.2 |
| 50 mM sodium citrate, pH 7.2 | |||
| RNase solution (0.25 mg / mL) | Sigma | R6513 | 0.25 mg / mL RNaseA resuspended in 50 mM sodium citrate, pH 7.2, boil RNase solution for 10 minutes before the first use only, and from then on store at -20° |
| proteinase K solution (20 mg / mL) | ThermoFisher / Invitrogen | 25530-015 | resuspend in 10 mM Tris, pH 7.5, 2 mM CaCl2, 50% glycerol, store at -20°C |
| Model 50 Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FB50A220 | |
| BD Biosciences FACSAria II | BD Biosciences | 644832 | |
| Zymo-spin III columns | Zymo Research | C1005 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | ThermoFisher | Q32851 | |
| Qubit 3.0 Fluorometer | ThermoFisher | Q33216 | |
| Covaris Model LE220 Focused-Ultrasonicator | Covaris | 500219 | |
| Illumina TruSeq DNA LT Sample Prep Kit | Illumina | 15026486 | |
| Illumina HiSeq 2500 instrument | Illumina | SY–401–2501 | |
| gsnap alignment software | open source software / Genentech | http://research-pub.gene.com/gmap |
References
- Fragkos, M., Ganier, O., Coulombe, P., Mechali, M. DNA replication origin activation in space and time. Nat Rev Mol Cell Biol. 16, 360-374 (2015).
- Santocanale, C., Diffley, J. F. A Mec1- and Rad53-dependent checkpoint controls late-firing origins of DNA replication. Nature. 395, 615-618 (1998).
- Brewer, B. J., Fangman, W. L. A replication fork barrier at the 3′ end of yeast ribosomal RNA genes. Cell. 55, 637-643 (1988).
- Raghuraman, M. K., et al. Replication dynamics of the yeast genome. Science. 294, 115-121 (2001).
- Muller, C. A., Nieduszynski, C. A. Conservation of replication timing reveals global and local regulation of replication origin activity. Genome Res. 22, 1953-1962 (2012).
- Koren, A., Soifer, I., Barkai, N. MRC1-dependent scaling of the budding yeast DNA replication timing program. Genome Res. 20, 781-790 (2010).
- Lang, G. I., Murray, A. W. Mutation rates across budding yeast chromosome VI are correlated with replication timing. Genome Biol Evol. 3, 799-811 (2011).
- Durkin, S. G., Glover, T. W. Chromosome fragile sites. Annu Rev Genet. 41, 169-192 (2007).
- Dillon, L. W., Burrow, A. A., Wang, Y. H. DNA instability at chromosomal fragile sites in cancer. Curr Genomics. 11, 326-337 (2010).
- Widrow, R. J., Hansen, R. S., Kawame, H., Gartler, S. M., Laird, C. D. Very late DNA replication in the human cell cycle. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 11246-11250 (1998).
- Foss, E. J., et al. SIR2 suppresses replication gaps and genome instability by balancing replication between repetitive and unique sequences. Proc Natl Acad Sci U S A. 114, 552-557 (2017).
- Wu, T. D., Reeder, J., Lawrence, M., Becker, G., Brauer, M. J. GMAP and GSNAP for Genomic Sequence Alignment: Enhancements to Speed, Accuracy, and Functionality. Methods Mol Biol. 1418, 283-334 (2016).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26, 841-842 (2010).
- Langmead, B. Aligning short sequencing reads with Bowtie. Curr Protoc Bioinformatics. , 17 (2010).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 25, 1754-1760 (2009).
- Kellis, M., Birren, B. W., Lander, E. S. Proof and evolutionary analysis of ancient genome duplication in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 428, 617-624 (2004).
- Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies. Nat Rev Genet. 17, 333-351 (2016).
