G2-seq: عالية إنتاجية على أساس تسلسل تقنية لتحديد تكرار متأخر مناطق الجينوم
Summary
يصف لنا تقنية للجمع بين التدفق الخلوي وتسلسل الإنتاجية العالية لتحديد مناطق تكرار التأخر الجينوم.
Abstract
وقد وضعت العديد من التقنيات لمتابعة التقدم المحرز في تكرار الحمض النووي من خلال المرحلة S من دورة الخلية. وتم توجيه معظم هذه التقنيات نحو توضيح مكان وتوقيت بدء ازدواج الجينوم بدلاً من إتمامها. ومع ذلك، من المهم أن نفهم مناطق الجينوم التي آخر لإكمال النسخ المتماثل، نظراً لأن هذه المناطق تعاني من مستويات مرتفعة من الكسر الصبغية والطفرات، وأنها كانت مرتبطة بالمرض والشيخوخة. هنا يصف لنا كيف قدمنا تقنية التي استخدمت لرصد بدء النسخ المتماثل بدلاً من ذلك تحديد تلك المناطق للجينوم آخر لإكمال النسخ المتماثل. ويستند هذا النهج مزيجاً من التدفق الخلوي وتسلسل إنتاجية عالية. على الرغم من أن هذا التقرير يركز على تطبيق هذه التقنية على الخميرة، يمكن استخدام هذا النهج مع أي الخلايا التي يمكن تخزينها في سيتوميتير تدفق وفقا لمحتوى الحمض النووي.
Introduction
يتم بدء النسخ المتماثل للجينوم حقيقية النواة في عدة مواقع منفصلة، تسمى أصول النسخ المتماثل للنسخ المتماثل التي تنطلق شوك في كلا الاتجاهين (استعرض في فركوس et al.، 20151). أصول تختلف في التوقيت والكفاءة لإطلاق النار على حد سواء، وقد وضعت العديد من التقنيات مراقبة نشاط المنشأ النسخ المتماثل وتوضيح أسباب هذا الاختلاف. النشاط الفردي إلى أصول يمكن أن يستدل من مستويات واحدة-الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي2، الذي يشكل حول أصول نشطة، أو باستخدام هلام 2D التفريد لمراقبة النسخ المتماثل محددة وسيطة3، اللتين يمكن اكتشافه مع المسابر المشعة. كل من هذه التقنيات تطبق بسهولة أكبر في S. cerevisiae مما في خلايا الثدييات، لأن أصول محدودة لمتواليات محددة معروفة في السابق. ومع ظهور [ميكروارس]، أصبح من الممكن لتقييم الأصل يطلقون النار على الصعيد العالمي. وكان ذلك أولاً بوسم الحمض النووي مع النظائر الثقيلة وإطلاق الخلايا من كتلة G1 في النظائر الخفيفة التي تحتوي على المتوسط ثم رصد تشكيل الهجين الخفيفة الثقيلة الحمض النووي عبر الجينوم4. إدخال تسلسل إنتاجية عالية سمح مماثلة على نطاق الجينوم رصد نشاط المنشأ دون اشتراط وسم النظائر باهظة الثمن. تم فرز الخلايا في سيتوميتير تدفق وفقا لمحتوى الحمض النووي وعينات من الحمض النووي تخضع لتسلسل عميق. لأن التغطية تسلسل عائدات من س 1 إلى 2 x خلال المرحلة S، يمكن تقييم توقيت تكرار نسبي بمقارنة قراءة أعماق الخلايا في مرحلة ثانية إلى تلك الموجودة في G1 أو G25،6. وأدت هذه التقنيات، خاصة تطبق على الخميرة، إلى فهم أعمق لكيفية تنظيم تسلسل الحمض النووي وهيكل الكروماتين، والبروتينات النسخ المتماثل الحمض النووي توقيت المنشأ والكفاءة.
المؤمنين انتقال المعلومات الوراثية من خلال انتشار الهاتف الخلوي يتطلب ليس فقط نجاح بدء تكرار الحمض النووي، الذي يقام في أصول، ولكن أيضا إتمام النسخ المتماثل, الذي يحدث حيث يجتمع شوك النسخ المتماثل بنجاح. مثل بدء النسخ المتماثل، يختلف توقيت الانتهاء من النسخ المتماثل عبر الجينوم مع بعض المناطق المتبقية unreplicated حتى وقت متأخر في دورة الخلية. هذه المناطق قد تكون خاصة بعيدة عن أصول النسخ المتماثل النشط أو قد تحتوي على تسلسلات أو هياكل الكروماتين التي تعوق بولمرس الحمض النووي. تأخر النسخ المتماثل المناطق يمكن أن تعبر عن نفسها كالمواقع الهشة، والتي ترتبط بمعدلات الطفرة والكسر الصبغية، وقد تورط في السرطان وشيخوخة7،،من89. ومع ذلك، على الرغم من أهمية الإنجاز السليم لتكرار الحمض النووي في صون الاستقرار الجينوم، فهمنا لاين وكيف يحدث ذلك تخلفت لبدء النسخ المتماثل. وبينما الجينات الفردية النسخ المتماثل المتأخرة التي تم إقرانها مع المرض وقد درست مع، على سبيل المثال، قبكر10، الدراسات العالمية التي تستهدف توضيح المواقع والأسباب في وقت متأخر قد تفتقر إلى النسخ المتماثل. هنا يصف لنا تقنية نشير إليه بوصفه “seq G2” التي نجمع بين التدفق الخلوي مع تسلسل الإنتاجية العالية لتسليط الضوء على إكمال النسخ المتماثل الجينوم في الخميرة11. مع بعض التغييرات الطفيفة، يمكن أن تتكيف مع هذا البروتوكول أي الخلايا التي يمكن فرز التدفق وفقا لمحتوى الحمض النووي.
Protocol
Representative Results
Discussion
في حين أن هذا الأسلوب قوية ومستقيمة نسبيا، ينبغي إيلاء اهتمام خاص لما يلي:
(1) نوصي بأن الثقافات تنمو على الأقل 12 ح قبل أن تصل إلى مرحلة سجل، نظراً لاختلافات واضحة في توزيع دورة الخلية إذا الثقافات يتم حصادها بعد بعد أن بلغت ح الكثافة المطلوب 4 فقط بعد التطعيم. لدينا الافتراض ه?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
بتأييد هذا العمل بمنحه GM117446 المعاهد الوطنية للصحة أن أتال بيهاري
Materials
| YeaStar Genomic DNA kit | Genesee Scientific | 11-323 | |
| 1 µM SYTOX Green | ThermoFisher | 57020 | resuspend in 50 mM sodium citrate, pH 7.2 |
| 50 mM sodium citrate, pH 7.2 | |||
| RNase solution (0.25 mg / mL) | Sigma | R6513 | 0.25 mg / mL RNaseA resuspended in 50 mM sodium citrate, pH 7.2, boil RNase solution for 10 minutes before the first use only, and from then on store at -20° |
| proteinase K solution (20 mg / mL) | ThermoFisher / Invitrogen | 25530-015 | resuspend in 10 mM Tris, pH 7.5, 2 mM CaCl2, 50% glycerol, store at -20°C |
| Model 50 Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FB50A220 | |
| BD Biosciences FACSAria II | BD Biosciences | 644832 | |
| Zymo-spin III columns | Zymo Research | C1005 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | ThermoFisher | Q32851 | |
| Qubit 3.0 Fluorometer | ThermoFisher | Q33216 | |
| Covaris Model LE220 Focused-Ultrasonicator | Covaris | 500219 | |
| Illumina TruSeq DNA LT Sample Prep Kit | Illumina | 15026486 | |
| Illumina HiSeq 2500 instrument | Illumina | SY–401–2501 | |
| gsnap alignment software | open source software / Genentech | http://research-pub.gene.com/gmap |
References
- Fragkos, M., Ganier, O., Coulombe, P., Mechali, M. DNA replication origin activation in space and time. Nat Rev Mol Cell Biol. 16, 360-374 (2015).
- Santocanale, C., Diffley, J. F. A Mec1- and Rad53-dependent checkpoint controls late-firing origins of DNA replication. Nature. 395, 615-618 (1998).
- Brewer, B. J., Fangman, W. L. A replication fork barrier at the 3′ end of yeast ribosomal RNA genes. Cell. 55, 637-643 (1988).
- Raghuraman, M. K., et al. Replication dynamics of the yeast genome. Science. 294, 115-121 (2001).
- Muller, C. A., Nieduszynski, C. A. Conservation of replication timing reveals global and local regulation of replication origin activity. Genome Res. 22, 1953-1962 (2012).
- Koren, A., Soifer, I., Barkai, N. MRC1-dependent scaling of the budding yeast DNA replication timing program. Genome Res. 20, 781-790 (2010).
- Lang, G. I., Murray, A. W. Mutation rates across budding yeast chromosome VI are correlated with replication timing. Genome Biol Evol. 3, 799-811 (2011).
- Durkin, S. G., Glover, T. W. Chromosome fragile sites. Annu Rev Genet. 41, 169-192 (2007).
- Dillon, L. W., Burrow, A. A., Wang, Y. H. DNA instability at chromosomal fragile sites in cancer. Curr Genomics. 11, 326-337 (2010).
- Widrow, R. J., Hansen, R. S., Kawame, H., Gartler, S. M., Laird, C. D. Very late DNA replication in the human cell cycle. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 11246-11250 (1998).
- Foss, E. J., et al. SIR2 suppresses replication gaps and genome instability by balancing replication between repetitive and unique sequences. Proc Natl Acad Sci U S A. 114, 552-557 (2017).
- Wu, T. D., Reeder, J., Lawrence, M., Becker, G., Brauer, M. J. GMAP and GSNAP for Genomic Sequence Alignment: Enhancements to Speed, Accuracy, and Functionality. Methods Mol Biol. 1418, 283-334 (2016).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26, 841-842 (2010).
- Langmead, B. Aligning short sequencing reads with Bowtie. Curr Protoc Bioinformatics. , 17 (2010).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 25, 1754-1760 (2009).
- Kellis, M., Birren, B. W., Lander, E. S. Proof and evolutionary analysis of ancient genome duplication in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 428, 617-624 (2004).
- Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies. Nat Rev Genet. 17, 333-351 (2016).
