تخصيص صفائف الببتيد للكشف عن Alloantibodies هلا في زرع الأعضاء
Summary
عدم التطابق في الكريات البيض البشرية مستضد (هلا) تسلسل بين الهيئة المانحة والمتلقية أزواج هي السبب الرئيسي للرفض بوساطة الأضداد في زرع الأعضاء. نقدم هنا استخدام صفائف مستضد مخصصة تستند إلى هلا تسلسلات فرادى المانحين للتحقيق المضادة المانحين هلا اللوانتيبوديس في الجهاز المتلقين.
Abstract
في زرع الأعضاء، وظيفة وطول العمر للفساد خطيرة تعتمد على نجاح السيطرة على مفاعليه الرفض المناعية ضد مستضدات الكريات البيض البشرية (HLA). تستند المبادئ التوجيهية histocompatibility الاختبارات المعملية هلا مكافحة الحصانة، التي تقدم أما كالموجودة مسبقاً أو إنشاء حيثياته هلا الأجسام المضادة التي تشكل حاجزاً يحول دون زرع رئيسية. الاختبارات الحالية مبنية على منصة واحدة-مستضد خرز (SAB) باستخدام مجموعة ثابتة من المستضدات هلا المؤتلف المختارة ~ 100 للتحقيق الأمصال زرع. ومع ذلك، توجد في البشر مجموعة أكبر بكثير من أنواع هلا، مع لا اثنين من الأفراد عدا التوائم الذين يمكن أن تتقاسم نفس تركيبة من تسلسلات هلا. بينما التكنولوجيات المتقدمة لكتابة هلا ومباشرة يسلسل دقة التقاط أي عدم التطابق في تسلسل الحمض النووي بين المانحين وهلا المستلم، مقايسة صاب، نظراً لتنوع محدود في تسلسل التمثيل، غير قادر على الكشف عن الذات اللوانتيبوديس على وجه التحديد ضد عدم التطابق هلا الجهات المانحة. سعينا لتطوير طريقة تكميلية باستخدام تقنية مختلفة لكشف وتوصيف الأجسام المضادة هلا المضادة المانحين على أساس شخصي. أداة الفحص مجموعة ببتيد مخصصة من المانحين المستمدة من هلا تسلسلات لسبر سيرا بعد زرع جهاز المستلم لتقييم المخاطر لرفض جسم بوساطة. في صفيف مفرد لزوج مانح ومتلق واحد، ما يصل إلى 600 من الببتيدات فريدة من نوعها يتم على أساس تسلسل البروتين هلا الجهة المانحة، الببتيد كل حمل واحد على الأقل للمخلفات غير متطابقة في تسلسل الأحماض أمينية 15. في تجاربنا التجريبية لمقارنة أنماط مستضد للأمصال ما قبل وما بعد زرع الأعضاء على هذه المصفوفات، كنا قادرين على كشف الإشارات المضادة-هلا مع القرار أيضا تسمح لنا بتحديد [ابيتوبس] محصنة ضد المتورطين. وهذه شخصية صفائف مستضد تتيح كشف عالية الدقة الخاصة بالمانحين هلا [ابيتوبس] في زرع الأعضاء.
Introduction
الجهاز استبدال العلاج التي تتم بشكل روتيني عبر العالم قد أنقذ حياة الملايين. زرع الأعضاء الصلبة يحدث في المرضى حوالي 100 مليون نسمة في الولايات المتحدة سنوياً، بينما عدد أكبر لا تزال في ويتليستس لتلقي الهيئات المانحة بسبب نقص حاد في إمدادات (وفقا للمعلومات المقدمة من الهيئة المشتريات وزرع شبكة-اوبشن/الشبكة: optn.transplant.hrsa.gov). الغاية ينظم زرع الأعضاء بغية الحد من النفايات الجهاز وإنقاذ الأرواح، ولكن الأدوات العلمية المستخدمة لإعلام هذه الأنظمة محدودة الفعالية. على سبيل المثال، وتدرك الأوساط العلمية تماما الدول عالية متعددة الأشكال من جزيئات هلا ودقة الاختبارات الجينية للحمض النووي باستخدام كتابة الاستبانة، وتستند إلى تسلسل كتابة (السبط) قد وضعت في السنوات الأخيرة1، 2. بيد اللوانتيبودي طرق الاختبار لم قادرة على إنتاج تشكيلة واسعة من تسلسلات هلا الفردية كتحقيقات مستضد. يستخدم الاختبار القياسية في الوقت الحاضر فريق ثابت ~ 100 الاليلي المستضدات التي تتألف من المتغيرات الشائعة من هلا، ألف، باء وجيم, DQ, DP والدكتور تسلسل في المجموعات السكانية البشرية3،4،،من56. وكثيراً ما هلا تسلسلات الفعلية للمانحين غير مدرجة في لوحة الاختبار، مما اضطر زرع الأطباء والجراحين للاستدلال مفاعليه مانحة على حدة استناداً إلى أوجه التشابه المشتركة بين تسلسلات الفعلية للجهات المانحة والمقابلة “معايير” في اختبار تعيين7،8. ونتيجة لذلك، وأحيانا تحديا لجعل إجراء تقدير موثوق لمخاطر الرفض استناداً إلى جسم اختبار النتائج9،10،،من1112. ولذلك، جديدة شخصيا تجارب قابلة للتخصيص ل alloantibodies هي تشتد13،14.
ترميز الجينات هلا المستقبلات (MHC) histocompatibility الرئيسية المعقدة التي لها وظيفة رئيسية في الاستجابات المناعية6. هلا الجينات من المعروف أن جينات متعددة الأشكال الأكثر الجينوم البشري6. بسبب التقدم السريع في الحمض النووي تسلسل استراتيجيات للجينات هلا، المتغيرات الجينية الجديدة (أو يشار إليها ببساطة الآليلات) يجري اكتشافها في معدل متفجرة15،16. بحلول عام 2017 في آذار/مارس، أودع في إيمجت/هلا قاعدة البيانات (http://www.ebi.ac.uk/ipd/index.html)، 16,755 الآليلات مصادق عليه من 12,351 التي كانت من فئة أنا وكانت 4,404 من الدرجة الثانية المجموعات. في تناقض صارخ، الآليلات متميزة إلا قليلاً ما يزيد على 100 ممثلة في مقايسة الخرز مستضد واحد قياسي (SAB)، التي تستخدم بشكل روتيني للكشف عن alloantibodies في زرع الأعضاء. الأسلوب صاب مبنية على منصة لوميناكس استخدام التدفق الخلوي. يمكن منذ المقايسة تستخدم مجموعة ثابتة من مولدات المضادات، وبصرف النظر عن التقلبات دفعة لدفعة طفيفة في الإنتاج، وتكون موحدة عبر الأفراد والمختبرات5قوة الاختبار antiserum. ولكن هذا الاختبار غير قادر على التقاط جميع اللوانتيبوديس وضعت على وجه التحديد ضد الآليلات المانحين، لا سيما عند تسلسل الجهات المانحة التي غائبة من الديوان تعيين. على الرغم من أن إنتاج مخصصة المستضدات الجهات المانحة استناداً إلى تسلسل صحيح المرغوب فيه، لا تزال هناك تحديات التقنية في ترشيد الإنتاج اللازمة وإجراءات الاختبار.
نحن مؤخرا وصف منهجية بديلة في إجراء دراسة جدوى لزرع الكلي مواضيع17. الأسلوب تستخدم مولدات الببتيد في صيغة صفيف لسبر ما قبل وما بعد زرع الأمصال لكل موضوع على حدة. كل مجموعة كانت مخصصة تم إنشاؤها باستخدام بقعة التوليف أسلوب18،19،20،21،22،23 التي تنتج المستضدات الببتيد، كل 15 الأحماض الأمينية في الطول، وتستند كلياً إلى هلا الآليلات الهيئة المعنية للمانحين أ، ب، ج، DQA1، DQB1 و DRB1. ويدار على غشاء السليولوز باستخدام معيار معتدلاً-الكيمياء22 توليف بقعة ويمكن أن تنتج مئات الببتيدات مخصصة بالتوازي مع19،نظام روبوتية مؤتمتة بالكامل21. يمكن أن تحمل الصفيف غشاء جولات متعددة من تجريد ودورات ريبروبينج. لدينا دراسة استعادية17، نحن الكشف عن التغييرات في أنماط مستضد مع أنتيسيرا زرع المخزن التي تم جمعها في سلسلة زمنية (أي، قبل وبعد زرع الأعضاء). هنا يصف لنا البروتوكول التقنية لسير العمل بما في ذلك تصميم مصفوفة، والصناعات التحويلية، antiserum السبر ونتيجة التحليل. الأسلوب المقصود للكشف عن alloantibodies ضد [ابيتوبس] خطية محددة على هلا الجزيئات زرع المانحين.
Protocol
Representative Results
Discussion
تصميم الصفيف بقعة الموصوفة هنا للدراسة التجريبية لخصوصية اللوانتيبودي في زرع ضد المستضدات هلا مانحا الجهاز. على النقيض من مقايسة صاب القائمة المستخدمة على نطاق واسع في العيادة، لديه أسلوب صفيف مستضد ميزة كبيرة في التصميم المرنة التي يمكن أن تستوعب تسلسلات هلا الحقيقية للجهات المانحة ال?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نشكر الدكتور شون لي ولي شينغ من جامعة ويسترن في كندا على مساعدتهم الطيبة مع بقعة صفيف الإنتاج. ونحن ممتنون للموظفين في “صلب هيستوكومباتيبيليتي” وفي جامعة “شاملة زرع مركز من شمال غرب” لتوفير خدمات عينة. تم دعم هذا العمل جزئيا “المجلس مساعدة من المستشفى التذكاري شمال غربي البلاد”، وصندوقا لبدء تشغيل كلية المقدمة من جامعة نورث وسترن لشئون.
Materials
| Peptide array | INTAVIS Bioanalytical Instruments | ||
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Ponceau S solution | Sigma-Aldrich | P7170 | |
| Non-fat milk | Bio Rad Laboratories | 1706404 | |
| TBST | Santa Cruz Biotechnology | 10711454001 | |
| Goat anti-human IgG–HRP | ThermoFisher Scientific | A18811 | |
| Clarity Western ECL Substrate | Bio Rad Laboratories | 1705061 | |
| Restore Western Blot Stripping Buffer | Thermo Scientifics | 21059 | |
| ChemiDoc gel imaging system | Bio Rad Laboratories | 1708265 |
References
- Bradshaw, R. A., Dunn, P. P. Unambiguous high resolution genotyping of human leukocyte antigens. J Immunol Methods. , (2017).
- Robinson, J., Halliwell, J. A., McWilliam, H., Lopez, R., Marsh, S. G. IPD–the Immuno Polymorphism Database. Nucleic Acids Res. 41, D1234-D1240 (2013).
- Tait, B. D. Solid phase assays for HLA antibody detection in clinical transplantation. Curr Opin Immunol. 21 (5), 573-577 (2009).
- Tait, B. D. Detection of HLA Antibodies in Organ Transplant Recipients – Triumphs and Challenges of the Solid Phase Bead Assay. Front Immunol. 7, 570 (2016).
- Gebel, H. M., Bray, R. A. HLA antibody detection with solid phase assays: great expectations or expectations too great?. Am J Transplant. 14 (9), 1964-1975 (2014).
- Horton, R., et al. Gene map of the extended human MHC. Nat Rev Genet. 5 (12), 889-899 (2004).
- Duquesnoy, R. J. HLAMatchmaker: a molecularly based algorithm for histocompatibility determination I. Description of the algorithm. Hum Immunol. 63 (5), 339-352 (2002).
- Duquesnoy, R. J., Marrari, M. HLAMatchmaker-based definition of structural human leukocyte antigen epitopes detected by alloantibodies. Curr Opin Organ Transplant. 14 (4), 403-409 (2009).
- Wedel, J., Bruneau, S., Kochupurakkal, N., Boneschansker, L., Briscoe, D. M. Chronic allograft rejection: a fresh look. Curr Opin Organ Transplant. 20 (1), 13-20 (2015).
- Rostaing, L. P., Malvezzi, P. HLA-Incompatible Kidney Transplantation–Worth the Risk?. N Engl J Med. 374 (10), 982-984 (2016).
- Gebel, H. M., Bray, R. A., Nickerson, P. Pre-transplant assessment of donor-reactive, HLA-specific antibodies in renal transplantation: contraindication vs. risk. Am J Transplant. 3 (12), 1488-1500 (2003).
- Haas, M. An updated Banff schema for diagnosis of antibody-mediated rejection in renal allografts. Curr Opin Organ Transplant. 19 (3), 315-322 (2014).
- Cecka, J. M., Reed, E. F., Zachary, A. A. HLA high-resolution typing for sensitized patients: a solution in search of a problem?. Am J Transplant. 15 (4), 855-856 (2015).
- Tambur, A. R., Claas, F. H. HLA epitopes as viewed by antibodies: what is it all about?. Am J Transplant. 15 (5), 1148-1154 (2015).
- Robinson, J., et al. The IPD and IMGT/HLA database: allele variant databases. Nucleic Acids Res. 43, D423-D431 (2015).
- Gabriel, C., et al. HLA typing by next-generation sequencing – getting closer to reality. Tissue Antigens. 83 (2), 65-75 (2014).
- Liu, P., et al. A Novel Method for Anti-HLA Antibody Detection Using Personalized Peptide Arrays. Transplant Direct. 2 (11), (2016).
- Frank, R., Overwin, H. SPOT synthesis. Epitope analysis with arrays of synthetic peptides prepared on cellulose membranes. Methods Mol Biol. 66, 149-169 (1996).
- Frank, R. The SPOT-synthesis technique. Synthetic peptide arrays on membrane supports–principles and applications. J Immunol Methods. 267 (1), 13-26 (2002).
- Amartely, H., Iosub-Amir, A., Friedler, A. Identifying protein-protein interaction sites using peptide arrays. J Vis Exp. (93), (2014).
- Kudithipudi, S., Kusevic, D., Weirich, S., Jeltsch, A. Specificity analysis of protein lysine methyltransferases using SPOT peptide arrays. J Vis Exp. (93), e52203 (2014).
- Hilpert, K., Winkler, D. F., Hancock, R. E. Peptide arrays on cellulose support: SPOT synthesis, a time and cost efficient method for synthesis of large numbers of peptides in a parallel and addressable fashion. Nat Protoc. 2 (6), 1333-1349 (2007).
- McBride, R., Head, S. R., Ordoukhanian, P., Law, M. Low-Cost Peptide Microarrays for Mapping Continuous Antibody Epitopes. Methods Mol Biol. 1352, 67-83 (2016).
- Li, S. S., Wu, C. Using peptide array to identify binding motifs and interaction networks for modular domains. Methods Mol Biol. 570, 67-76 (2009).
- Kaczmarek, I., et al. Donor-specific HLA alloantibodies: long-term impact on cardiac allograft vasculopathy and mortality after heart transplant. Exp Clin Transplant. 6 (3), 229-235 (2008).
- Claas, F. H. Clinical relevance of circulating donor-specific HLA antibodies. Curr Opin Organ Transplant. 15 (4), 462-466 (2010).
- Brown, N. K., Kheradmand, T., Wang, J., Marino, S. R. Identification and characterization of novel HLA alleles: Utility of next-generation sequencing methods. Hum Immunol. 77 (4), 313-316 (2016).
- Cino, E. A., Choy, W. Y., Karttunen, M. Conformational Biases of Linear Motifs. Journal of Physical Chemistry B. 117 (50), 15943-15957 (2013).
- Duquesnoy, R. J. Human leukocyte antigen epitope antigenicity and immunogenicity. Curr Opin Organ Transplant. 19 (4), 428-435 (2014).
- Lavinder, J. J., et al. Identification and characterization of the constituent human serum antibodies elicited by vaccination. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (6), 2259-2264 (2014).
- Kloetzel, P. M. Antigen processing by the proteasome. Nat Rev Mol Cell Biol. 2 (3), 179-187 (2001).
- Filippone, E. J., Farber, J. L. The Humoral Theory of Transplantation: Epitope Analysis and the Pathogenicity of HLA Antibodies. J Immunol Res. 2016, 5197396 (2016).
- Claas, F. H., Witvliet, M. D., Duquesnoy, R. J., Persijn, G. G., Doxiadis, I. I. The acceptable mismatch program as a fast tool for highly sensitized patients awaiting a cadaveric kidney transplantation: short waiting time and excellent graft outcome. Transplantation. 78 (2), 190-193 (2004).
