臓器移植における HLA 同種抗体の検出のためのペプチド配列をお好み
Summary
ひと白血球抗原 (HLA) シーケンス臓器提供者と受信者のペア間の不一致は、臓器移植での拒絶反応の抗体の主要な原因です。レシピエントの抗ドナー HLA 同種抗体をプローブする個々 のドナーの HLA シーケンスに基づくカスタム抗原配列の使用をご紹介します。
Abstract
関数とグラフトの長寿は臓器移植における批判的にひと白血球抗原 (HLA) に対する免疫学的拒絶反応の制御の成功に依存します。適合ガイドラインとして既存のいずれかを示す抗 HLA 免疫の検査に基づいているまたはde novoが主要な移植の障壁を構成する HLA 抗体を生成します。現在のテストは、〜 100 事前に選択された組換え HLA 抗原の固定セットを使って移植血清を調べる単一抗原ビーズ (SAB) プラットフォームに基づいて構築されます。しかし、人間まで多様な HLA 型は、同じ HLA シーケンスの組み合わせを共有することができます一卵性双生児以外ないの 2 人が存在します。HLA タイピングと直接配列の高度な技術は、間ドナーの DNA シーケンスの不整合をキャプチャすることが正確に、受信者の HLA、SAB 試金、シーケンスの表現、その限られた変化のためには正確に検出することができます。ドナーの HLA 不一致に対して同種抗体。我々 は個人ごとに抗ドナー HLA 抗体の特徴を検出して別の技術を使用して相補的な手法を開発しようとしました。スクリーニング ツールは移植後血清抗体関連型拒絶反応のリスクを評価するために臓器の受信者をプロービングのためドナー HLA 派生系列のカスタム ペプチド配列です。ドナーと受信者の 1 つのペアの 1 つの配列に 600 のユニークなペプチドまでに基づいて行われますドナーの HLA タンパク質配列、各ペプチド、15 アミノ酸配列で、少なくとも 1 つの不一致残渣を運ぶします。これらのアレイで前と移植後の血清の抗原パターンを比較するパイロット実験で抗 HLA も関与する免疫抗原を特定することができました解像度の信号を検出することができました。パーソナライズされたこれら抗原配列は臓器移植におけるドナーの HLA 抗原の高分解能の検出を許可します。
Introduction
世界中で日常的に行われている臓器置換療法は、数百万の命を救っています。固形臓器移植、米国で 100万人あたり約 100 人の患者で発生します毎年、大きい数はまだ待ちでいる臓器 (器官によって提供される情報によると供給の厳しい不足を受信する間調達および移植ネットワーク – OPTN/全米: optn.transplant.hrsa.gov)。臓器移植臓器の廃棄物の削減し、命を救うために規制されて、科学的なツールこれらの規制を通知するために使用は有効性で限られています。例えば、科学界は完全に HLA 分子の非常に多型の状態を認識し、高解像度入力し、シーケンス ベース (SBT) を用いた DNA の正確な遺伝子検査は、近年1,で開発されている2します。 ただし、alloantibody 試験方法がまだできていない抗原プローブとして多様な個々 の HLA のシーケンスを生成します。標準的なテストはこの頃不変のパネルを使用するを構成する HLA の共通の変形の ~ 100 の対立抗原の A、B、C、DQ、DP、DR は人口3,4,5,6シーケンスします。頻繁に実際のドナーの HLA シーケンスに含まれていないテストパネル、移植医師と外科医は、ドナーの実際のシーケンスと対応する「標準」の共有類似性に基づいてドナー固有反応性を推論する強制することで、テストは、7、8を設定します。その結果、信頼性の高い抗体テスト結果9,10、11,12に基づいて拒否リスク見積もりを行うに困難な場合があります。したがって、新しい個人的にカスタマイズのテスト同種抗体が緊急に必要な13,14 です。
HLA 遺伝子は免疫応答6にキー関数がある主要組織適合遺伝子複雑な (MHC) の受容体をエンコードします。HLA 遺伝子ヒトゲノム6の最も多型の遺伝子が知られています。DNA の急速な進歩による HLA 遺伝子、対立遺伝子の新しい亜種のための戦略をシーケンス (または対立遺伝子と単に呼ばれる)、爆発的な速度で15、16が発見されています。2017 年 3 月 16,755 検証された対立遺伝子入金されていた IMGT/HLA データベース (http://www.ebi.ac.uk/ipd/index.html) にどの 12,351 のクラスのだったらと 4,404 クラス II グループの。対照的にだけ少し以上 100 の異なる対立遺伝子は臓器移植における同種抗体を検出する使用標準的な単一抗原ビーズ (SAB) のアッセイで表されます。SAB 法はフローサイトメトリーを用いた Luminex プラットフォームに基づいて構築されます。アッセイを利用して生産、マイナーなバッチ変動以外の抗原の不変のセットからは、研究所5の個人間でしっかり抗血清テストを標準化できます。しかし、このテストはドナー シーケンスが不在であるときに特にドナーの対立遺伝子に対する具体的開発すべて同種抗体をキャプチャできません、SAB から設定します。真のシーケンスに基づくドナー抗原のカスタム生産が望ましいが、必要な生産の合理化及び試験手順の技術的な課題が残っています。
最近腎移植科目17のフィージビリティスタディにおける代替方法論について述べる。メソッドは、配列形式の事前調査のペプチド抗原を使用し、被験者の血清、移植後。各アレイは、スポット合成法18,19,20,21,22,23各 15 の抗原ペプチドを生成することを使用して構築されたカスタムされました。アミノ酸の長さは、完全に基づいてそれぞれの臓器ドナーの HLA 対立遺伝子 a、B、C、DQA1、DQB1 DRB1。スポット合成標準 fmoc 保護化学22を使用してセルロース膜で運営され、何百もの完全に自動化されたロボット システム19,21と並行してカスタム ペプチドを作り出すことができます。膜配列は、ストリッピングと reprobing サイクルの複数のラウンドを耐えることができます。私たちの回顧的研究17(すなわち前に、と移植後) 時系列で収集ストアド移植抗血清と抗原パターンの変化を検出します。ここ製造、抗血清の調査と結果分析して配列設計を含むワークフローのプロトコルの技術を説明します。メソッドは、同種移植ドナーの HLA 分子に特定の線形エピトープに対する抗体を検出するため。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで説明した点配列の設計は alloantibody 移植臓器のドナーの HLA 抗原に対する特異性に関する実験的研究。クリニックで広く使われる既存の SAB アッセイと対照をなして抗原配列方法個々 のドナーの真の HLA シーケンスに対応できる柔軟性のあるデザインの主要な利点があります。新しいプラットフォームをあいまいさ16,27せず正確な HLA allelic シ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々 に感謝夫妻ショーン李とスポットでそのような支援のためにカナダの西部大学の興李アレイ生産。サンプル サービスを提供する組織適合性コア、北西の包括的な移植センターの大学スタッフに感謝しております。この作品は、補助ノースウェスタン メモリアル ボード ホスピタル、JJ にノースウェスタン大学によって提供される学部スタートアップ資金、部分的にサポートされています。
Materials
| Peptide array | INTAVIS Bioanalytical Instruments | ||
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Ponceau S solution | Sigma-Aldrich | P7170 | |
| Non-fat milk | Bio Rad Laboratories | 1706404 | |
| TBST | Santa Cruz Biotechnology | 10711454001 | |
| Goat anti-human IgG–HRP | ThermoFisher Scientific | A18811 | |
| Clarity Western ECL Substrate | Bio Rad Laboratories | 1705061 | |
| Restore Western Blot Stripping Buffer | Thermo Scientifics | 21059 | |
| ChemiDoc gel imaging system | Bio Rad Laboratories | 1708265 |
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